不同酿酒酵母对脆红李果酒品质的影响

廖丽，毛晓云，王秋蓉，鲁叙彤，孔燕，姜林君，陈安均

(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625000)

脆红李(PrunussalicinaLindl. c.v. Cuihongli)属蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)[1]核果类水果，是中国李选育实生后代的晚熟品种，主要种植在川、渝、黔等西南地区。脆红李不仅富含多种维生素、氨基酸、有机酸、矿物质等有益人体的物质，还含有原花青素、花青素、黄酮苷等多种多酚类物质，有较强的抗氧化作用。目前李子主要被加工成果脯、蜜饯、果酱、果汁等产品[2]。近年来，对李子果酒香气成分的研究已有报道，如刘永衡等[3]采用溶剂萃取法对3种酵母发酵的幸运李子果酒香气成分进行了分析，但采用顶空固相微萃取法(solid phase micro-extraction, SPME)和气相色谱-质谱联用技术(gas chromatography mass spectrometry, GC-MS)分析不同酵母菌株对脆红李果酒挥发性风味物质影响的研究尚处于空白阶段。

酵母菌株是影响果酒香气成分的重要因素[4]。果酒酿造对菌株的要求较为严格，需有稳定的生长速率，不产生明显的异味，更重要的是需要保留水果中特征性的香气成分[5]。因此试验选用同一种脆红李，8种不同酿酒酵母，同一种工艺进行发酵，采用顶空固相微萃取法和气相色谱-质谱联用仪对8种酿酒酵母发酵后的果酒挥发性风味物质进行测定，并结合感官评定选取优良的酿酒酵母。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

脆红李，市购；酿酒酵母AC、KD、RC212、2323、D254、安琪、BRG、DV10，安琪酵母股份有限公司和帝伯士股份有限公司；环己酮(色谱纯)，上海阿拉丁试剂公司；乙醇(色谱纯)、NaOH、葡萄糖、CuSO4·5H2O(分析纯)，成都市科隆化学品有限公司；偏重亚硫酸钾(食品级)，浙江一诺生物科技有限公司司。

1.1.2 仪器与设备

GC-MS-2010气相色谱质谱联用仪(7890A/59750)，美国Agilent Technologies公司；50/30 μm PDMS/ DVB/CAR固相微萃取头(57328U)，上海安谱实验科技股份限公司；SPME手动进样柄(57330-U)，美国sigma公司；电热恒温水浴锅 (XMTD-7000)，北京市永光明仪器有限公司；HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Agilent公司。

1.1.3 酒样

筛选出成熟完好的新鲜脆红李，清洗后将脆红李切块去核去梗，用打浆机打浆，然后进行离心处理(8 000 r/min，离心10 min)得到脆红李汁。清液中添加蔗糖调整糖度至21 °Bx。再加入偏重亚硫酸钾调整SO2质量浓度至80 mg/L。将酵母菌株(0.03%)置于温水(35±1)℃中活化20 min后接种至脆红李汁中，在20 ℃下发酵14 d后倒灌，在20 ℃下陈酿1个月。

1.2 试验方法

1.2.1 理化指标的测定

依据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》对酒精度、还原糖、总糖、总酸等理化指标进行测定[6]。

1.2.2 香气成分分析

1.2.2.1 顶空固相微萃取

取5 mL原酒样于15 mL顶空瓶中，加入1 g NaCl和20 μL环己酮(27.337 g/L)，在水浴锅中50 ℃平衡10 min后，插入已老化好的萃取头(270 ℃老化30 min)，在50 ℃顶空吸附40 min后，插入GC-MS进样，解吸5 min[7]。

1.2.2.2 GC-MS条件

GC条件：HP-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，不分流进样，柱温采用程序升温，40 ℃保持8 min，以5 ℃/min升至75 ℃保持1 min，再以3.5 ℃/min升至125 ℃，再以5 ℃/min升至185 ℃保持1 min，再以10 ℃/min升至230 ℃保持20 min，进样温度260 ℃，检测器温度250 ℃，载气He[7]。

MS条件：电离方式EI，电离电压70 eV，灯丝电流0.25 mA，电子倍增器电压1 500 V，扫描范围m/z30～350。

定性方法：对检测到的脆红李果酒的风味物质在普库NIST11.L进行检索，选取匹配度在80%以上的物质确认为香气物质。

定量方法：采取半定量的方式进行计算，计算各挥发性成分的含量，如公式(1)所示[8]：

(1)

1.2.3 感官评价

挑选20位具有评审经验的师生组成评审小组，评分标准参照GB/T 15037—2006 《葡萄酒》[9]，主要从色泽、香气、口感、风格4个方面进行评价，具体标准如表1所示。感官评价得分以平均值计，满分100分[10]。

表1 脆红李酒感官评定表Table 1 Sensory evaluation of table Prunus salicinaLindl.c.v.Cuihongli wine

1.4 数据处理与统计

每个样品做3个平行，测量实验平行测量3次，最终数据以平均值±标准偏差表示。通过Microsoft Excel 2010软件进行分析；采用SPSS 22.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 基础理化指标

不同酵母菌发酵的脆红李果酒基础理化指标检测结果如表2所示，8株酵母菌发酵的脆红李果酒在酒精度、总酸、挥发酸、总糖、甲醇等各项指标中均存在显著性差异(P<0.05)。各菌株发酵的脆红李果酒酒精度>10.72%vol，其中菌株KD、D254、DV10发酵的脆红李果酒酒精度高于其他菌株。8株酵母菌发酵的脆红李果酒中总糖质量浓度<3 g/L，还原糖质量浓度<2 g/L，说明这些菌株降解糖能力强，发酵彻底。在总酸方面，总酸质量浓度<8.20 g/L，低于国家标准(4～9 g/L)[11]，菌株2323、安琪、AC、RC212、DV10、D254总酸含量无显著差异，BRG酵母菌株发酵的脆红李果酒，总酸含量最高，为8.17 g/L，其次是KD，总酸质量浓度为7.65 g/L。甲醇是果酒中有害的物质，其本身具有一定的毒性，饮用甲醇超标的果酒，会损害中枢神经系统和视网膜，严重可能会导致失明甚至死亡[12]。因此，果酒中的甲醇含量必须严格控制。在本试验条件下，8种脆红李果酒甲醇质量浓度<110 mg/L，远低于国家限量标准(≤400 mg/L)[13]，其中KD酵母菌发酵的脆红李果酒甲醇含量最高，为109.66 mg/L。SO2在脆红李果酒酿制过程中，能抑制杂菌生长，同时还具有抗氧化的作用，国家标准规定果酒中SO2质量浓度≤250 mg/L[14]，本实验中，8种脆红李果酒总SO2质量浓度<100 mg/L，在国家规定范围内。

表2 不同酵母菌株发酵的脆红李果酒的理化指标Table 2 Physico-chemical indexes of Prunus salicina Lindl. c. v. Cuihongli wine fermented by different yeast strains

2.2 不同酵母发酵的脆红李果酒中挥发性风味物质的分析

挥发性风味物质是决定果酒风味、品质和典型性的重要因素[15-16]。脆红李果酒挥发性风味物质的组成直接影响其感官品质，是评价脆红李果酒品质的一个重要指标。表3和表4为8种酵母菌株酿制的脆红李果酒，共检测出73种挥发性风味物质，其中酯类29种，醇类12种，醛酮类7种，酸类5种，酚类4种，烃类13种，其他类3种。不同脆红李果酒含挥发性风味物质种类依次为AC(49种)>KD(46种)=RC212(46种)>D254(42种)>2323(39种)>DV10(38种)=安琪(38种)>BRG(37种)。AC、D254、KD、RC212、BRG、DV10、2323、安琪8种酵母发酵的脆红李果酒挥发性风味物质总质量浓度分别为107 704.05、207 007.72、183 646.37、123 092.74、115 400.35、189 192.71、129 319.26、112 301.24 μg/L。由图1可知，酯类物质含量最高，其次是醇类，其中烃类含量最低。

图1 不同酵母菌株发酵的脆红李果酒挥发性风味物质质量浓度Fig.1 Content of volatile flavor compounds in Prunus salicina Lindl. c. v. Cuihongli wine fermented by different yeast strains

表3 不同酵母菌株发酵的脆红李果酒挥发性成分及质量浓度 单位：μg/L

续表3

表4 不同酵母菌株发酵的脆红李果酒挥发性成分及质量浓度 单位：μg/L

续表4

2.2.1 酯类物质分析

酯类物质是脆红李果酒中最主要的一类挥发性芳香物质，是酵母发酵的副产物[17]。8种脆红李果酒共检测出29种酯类物质，其中有17种酯类物质在各脆红李果酒都有检出。其酯类物质总质量浓度64 000.00～170 000.00 μg/L，分别占各酒样挥发性风味物质总量的60.25%、84.01%、68.89%、66.38%、66.50%、61.12%、69.82%、77.30%。酯类物质中辛酸乙酯质量浓度最高，达到63 085.22 μg/L，但只存在于D254酵母菌发酵的脆红李酒中，占其总酯类物质的30.47%；乙基9-癸烯酸酯、癸酸乙酯是脆红李果酒中含量较高的挥发性酯类物质，乙基9-癸烯酸酯分别占各酒样酯类物质总量的17.24%、12.20%、17.00%、15.68%、27.14%、18.39%、16.18%、25.32%；癸酸乙酯分别占各酒样酯类物质总量的15.10%、15.54%、17.47%、24.19%、15.10%、15.27%、18.65%、22.88%。大多数酯类物质具有花、果香气，如辛酸乙酯具有令人愉快的花果、杏子香气[18]；癸酸乙酯具有菠萝水果香、花香、甜香等[19]。

2.2.2 醇类物质分析

醇类物质是果酒中丰富的风味物质，赋予酒体水果香气，通常来源于糖类的分解代谢和氨基酸的脱氨、脱羧反应[20]。醇类化合物是酒的醇甜和助香剂的重要来源，是酯类化合物的前驱物质，其香气特征主要是水果香和花香[21]。8种脆红李果酒总共检测出12种醇类物质，其中3种醇类物质在各脆红李果酒都有检出。醇类物质总质量浓度为13 000.00～49 000.00 μg/L，分别占各酒样挥发性风味物质总量的24.21%、9.40%、19.02%、21.20%、20.97%、26.04%、17.66%、12.10%。苯乙醇是脆红李果酒中含量最高的醇类物质，分别占各酒样醇类物质总量的20.99%、8.17%、17.86%、19.03%、17.04%、24.51%、15.43%、8.53%。其中DV10发酵的脆红李果酒中苯乙醇含量最高，达到46 378.98 μg/L，安琪酵母发酵的脆红李果酒中苯乙醇含量最低，为9 576.71 μg/L。苯乙醇的香味独特，具有玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等多样风味[22]。

2.2.3 酸类物质分析

在酒类中，酸类物质主要来源于酒精发酵，其含量取决于发酵条件、营养物质含量和酵母的使用[23]，能为果酒增添酸爽的口感。试验总共鉴定出5种酸类物质，包括辛酸、癸酸、反,反-西基乙酸、十八碳九烯酸、月桂酸。酸类物质总质量浓度为5 000.00～14 000.00 μg/L，分别占各酒样挥发性风味物质总量的7.21%、2.87%、6.67%、5.43%、4.64%、7.75%、7.26%、4.70%。酸类物质含量最高的是KD和DV10发酵的脆红李果酒，分别达到了12 240.91、14 659.42 μg/L。辛酸是脆红李果酒中含量最丰富的挥发性酸类物质，能赋予酒体果味、桃子味、草莓味、菠萝味和糖果味等多种风味[23]。辛酸在DV10发酵的脆红李果酒中含量最高，达到14 551.57 μg/L，在BRG发酵的脆红李酒中最低，为5 279.98 μg/L。

2.2.4 醛酮类物质分析

果酒发酵过程中，不饱和脂肪酸能够在脂氧合酶的作用下代谢产生醛和酮[24]。试验总共检测出1种醛类物质和6种酮类物质，包括2-壬酮、大马酮、大马士酮、香叶基丙酮、甲基壬基甲酮、β-紫兰罗酮、苯甲醛。醛酮类物质总质量浓度为1 500.00～370 0.00 μg/L，分别占各酒样挥发性风味物质总量的1.65%、0.75%、2.06%、1.63%、2.37%、1.93%、1.48%、2.96%。8种脆红李果酒中苯甲醛总量在240.00～280 0.00 μg/L，安琪酵母发酵的脆红李果酒中苯甲醛含量高，AC酵母发酵的脆红李果酒中苯甲醛含量最低，苯甲醛具有杏仁香和焦甜香[25]。

2.2.5 烃类物质分析

8种脆红李果酒总共检测出13种烃类化合物，包括4-甲氧基苯乙烯、3,4-二甲氧基苯乙烯、(6E)-2,6-二甲基辛-2,6-二烯、(E)-β-金合欢烯、反式-β-金合欢烯、D-柠檬烯、萜品油烯、戊基环丙烷、正丁基环己烷、戊基环乙烷、二十八烷、茶香螺烷、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)苯。其中8种脆红李果酒都有检出(6E)-2,6-二甲基辛-2,6-二烯。酿酒酵母KD发酵酿制的脆红李果酒中特有的物质是D-柠檬烯、萜品油烯、二十八烷、1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)苯；茶香螺烷只存在于D254酵母酿制的脆红李果酒中；正丁基环己烷为AC酵母菌所酿脆红李果酒所独有；戊基环乙烷仅见于RC212酵母菌所酿制的脆红李果酒；反式-β-金合欢烯存在于BRG酵母酿制的脆红李酒中。

2.2.6 酚类物质和其他物质的分析

8种脆红李果酒中共检测出4种酚类物质和3种其他物质，包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、2,4-二叔丁基苯酚、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、丁香酚、茴香脑、2,6-二叔丁基苯醌、甲氧基苯基-肟。KD酵母发酵的脆红李酒中2,4-二叔丁基苯酚质量浓度最高，达到2 249.26 μg/L，BRG发酵的脆红李酒中2,4-二叔丁基苯酚质量浓度最低，为780.17 μg/L。其他3种物质含量相对较低，对整体香气影响不大。

2.3 脆红李果酒感官评价

香气是评价果酒品质的一个重要因素。通过GC-MS能够精确地测定果酒中挥发性风味物质的组成与含量，但是果酒的各种挥发性风味物质的含量、感官阈值和相互作用决定其最终的香气特征，因此特征组分的鉴定还需人体嗅觉感官分析才能够完成[26]。

由表5可知，8株菌株感官评分由高到低依次为RC212、AC、D254、2323、安琪、DV10、BRG、KD。综合挥发性风味物质总量、感官评价，酿酒酵母D254发酵的脆红李酒酒色清澈透明，色泽稳定，口感圆润柔和，香气持久迷人，具有脆红李酒的典型风格。本试验中RC212感官评分最高，但挥发性风味物质总量较低。D254虽然感官评分较RC212低1.02分，但挥发性风味物质总量最高，因此选择D254为脆红李酒的发酵菌株。

表5 不同酵母菌株发酵的脆红李果酒感官评价Table 5 Sensory evaluation of Prunus salicina Lindl.c.v.Cuihongli wine fermented by different yeast strains

3 结论

通过GC-MS分析了8株酵母发酵的脆红李果酒的挥发性风味物质的成分及含量。研究结果表明酿酒酵母对脆红李果酒中挥发性风味物质的成分及含量有较大影响。本试验总共检测出了73种挥发性风味物质，其中有27种物质在8种脆红李果酒中均有检出。D254酵母酿制的脆红李果酒挥发性风味物质的总质量浓度最高，达到了207 007.72 μg/L，其次是RC212，为183 646.37 μg/L，安琪酵母酿制的脆红李果酒挥发性风味物质的质量浓度最低，为112 301.24 μg/L。8种脆红李果酒的挥发性风味物质主体成分相接近，都含有正己酸乙酯、乙酸苄酯、乙酸己酯、苯乙醇、叶醇、辛酸等，但相对含量差异较大(P<0.05)。8种脆红李果酒中也有独有的香气物质，如茶香螺烷只存在于D254酵母酿制的脆红李果酒中。在感官方面，RC212感官评分最高，但根据仪器测定和感官评价综合判断，酿酒酵母菌株D254发酵的脆红李果酒挥发性风味物质含量最高、风味较好，具有脆红李果酒的典型风格。因此，酵母D254更适合于脆红李果酒的发酵。8株菌株酿制的脆红李果酒中，甲醇质量浓度(<110 mg/L)均远低于GB 15037—2006要求；总糖、还原糖、总酸及挥发酸含量的检测结果均符合GB 15037—2006。