食凉茶挥发油提取工艺及抗菌活性研究

李巧云

（丽水市职业高级中学，浙江丽水323000）

白色念珠菌是一种常见条件致病性真菌[1]，可寄居在人体不同部位，如皮肤、口腔、胃肠道等，引起皮肤、黏膜病变，也可引起危及生命的系统性感染。随着临床上浅部和深部真菌感染发病率不断增长，念珠菌感染发病率在逐年升高，白色念珠菌已经变成了重要的感染病原体之一。因此，寻找安全、有效的抗真菌药物一直是研究的热点。中草药在抗白色念珠菌感染的预防和治疗中具有一定的优势。

食凉茶属于畲族民间草药，为蜡梅科（Calycanthaceae）蜡梅属（Chimonanthus）植物，学名柳叶蜡梅（Chimonanthus salicifolius）[2]。食凉茶性凉，味微苦、辛。现代研究及临床试验表明：食凉茶有明显的解热镇痛、抗菌、抗病毒等作用，其中在抗菌方面，食凉茶挥发油被验证具有良好的生物活性。李萍[3]等人通过体内外抑菌实验发现山腊梅感冒茶对金黄色葡萄球菌感染有明显的抑制作用；刁君成[4]等人对山腊梅叶消毒抑菌作用开展了进一步的研究，发现山腊梅叶药片温热蒸发物质对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。但目前对其抗菌作用的研究主要集中在细菌感染方面，而抗真菌的报道较少。因此，本实验以食凉茶挥发油为研究对象，开展食凉茶挥发油体外抗真菌试验，希望能为民族医药抗真菌研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂

二氯甲烷、无水硫酸钠、吐温-80、RPMI1640液体培养基、刃天青（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 实验菌种和材料

白色念珠菌（中国普通微生物菌种保藏管理中心）、食凉茶（购自药材市场）。

1.3 仪器

XL-06B300克密封型摇摆式粉碎机（广州市旭朗机械设备有限公司）；TC-15恒温电热套（海宁市华星仪器厂）；挥发油测定器、超净工作台（博迅SW-CJ-1CU）等。

1.4 食凉茶挥发油提取方法

经粉碎后的食凉茶粉末，过20目标准筛。准确称取过筛后的药材粉末30 g置于圆底烧瓶中，加入玻璃珠数粒，按料液比加入蒸馏水，玻璃棒搅拌均匀。浸泡一段时间后，按2015版《中国药典》（通则2204）挥发油测定法甲法提取，停止加热，分取油层，用二氯甲烷萃取，再经无水硫酸钠干燥[5]，常温挥去二氯甲烷后采用减重法称定挥发油的重量，并计算挥发油提取率。

挥发油提取率（%）=提取的挥发油的重量（g）/药材粉末质量（g）×100%

1.5 菌液及药物的制备

将保存的白色念珠菌划线分离纯化后，挑取单菌落于沙氏液体培养基中振荡培养24 h，获得白色念珠菌菌液，用血细胞计数法[6]在显微镜下观察计数，用0.9%无菌生理盐水调整使初始菌悬液浓度控制在1.5×106CFU/mL。取适量初始菌悬液用RPMI1640液体培养基稀释1 000倍，使菌悬液的最终浓度控制在1×103～5×103CFU/mL，即得接种菌悬液。将挥发油以吐温-80溶解[7]后，用RPMI1640液体培养基倍比稀释，制取终质量浓度为500 mg/mL及1 mg/mL的挥发油药液，吐温-80终体积分数为0.005%（V/V）。

1.6 刃天青法检测挥发油对白色念珠菌最低抑菌浓度（MIC）

用96孔板微量稀释法[8-9]，制成含挥发油50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625、0.195 312 5和0.097 656 mg/mL的系列浓度药物，向1～11孔中各加100 μL接种菌悬液。第11孔为生长对照，第12孔为空白培养基对照，处理三组重复。96孔板用封口膜密封置于湿盒中，35℃培养12 h后向每孔中加入过滤除菌后的1 g/dL刃天青试剂2 μL，观察其颜色变化。以第11孔阳性对照由蓝色（氧化状态）变为粉红色（还原状态）、第12孔空白对照保持蓝色作为判断实验操作是否合格的标准。以发生颜色变化的前一孔为最低抑菌浓度（MIC）[10]。

2 结果与分析

2.1 食凉茶挥发油提取工艺的研究

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 提取时间的选择

设置提取时间为 0.5、1、1.5、2、2.5 h，料液比（mg/mL）为1:8，不浸泡，按1.4的方法进行提取并计算其提取率，结果如图1所示。提取开始时，食凉茶挥发油的提取率随时间的延长而增加，当提取时间为2 h时达到最高，随后又慢慢降低。分析：可能由于随着提取时间的增加，料液中的挥发油逐渐被提取完全，随后由于继续加热，使挥发油挥发，导致提取率有所下降。综上所述，因此选取1.5 h、2 h、2.5 h 进行正交实验。

2.1.1.2 浸泡时间的选择

设置料液比（mg/mL）为 1:8，提取 1.5 h，按 1.4的方法进行提取并计算其提取率，结果如图2所示。食凉茶挥发油提取率随浸泡时间的延长先增加后降低，在浸泡时间2 h处达到最高，说明浸泡时间对食凉茶挥发油的提取有影响。有研究[11-12]认为，浸泡可使植物组织细胞充分膨胀，细胞间隙变大，从而加快细胞内外物质的动态交换促进有效成分的溶出，但过度浸泡会使食凉茶组织受损，料液体系变得复杂，影响挥发油的提取，并可能导致挥发油的散失。故细化最佳浸泡时间，选择1.5 h、2.0 h、2.5 h进行后续正交实验。

2.1.1.3 料液比的选择

设置料液比（mg/mL） 为 1:8、1:10、1:12、1:14、1:16，提取时间为 1.5 h，不浸泡，按 1.4的方法进行提取并计算其提取率，结果如图3所示。在1:8～1:10间随着料液比的增加，食凉茶挥发油提取率上升趋势显著。而在1:10～1:14范围内，食凉茶挥发油提取率随料液比的增大稳定下降。虽然在1:16处有回升趋势，但料液比过大，容易导致料液暴沸，同时能耗也随之增加。因此从节约能源和提取效率角度考虑，实验选取1:9、1:10、1:11三个料液比梯度进行正交实验。

图1 提取时间对食凉茶挥发油提取率的影响

图2 浸泡时间对食凉茶挥发油提取率的影响

图3 料液比对食凉茶挥发油提取率的影响

2.1.2 正交试验

采用水蒸气蒸馏法，以食凉茶挥发油提取率为考察指标，以提取时间（A）、浸泡时间（B）、料液比（C）为影响因素[13]进行L9（33）正交试验设计[14]考察不同因素对挥发油提取率的影响。由表1极差分析可知，3个因素对食凉茶挥发油提取率的影响大小为B>C>A，即浸泡时间>料液比>提取时间。挥发油提取工艺的最佳组合为A2B3C2，即提取时间2.0 h，浸泡时间2.5 h，料液比1:10。

表1 食凉茶挥发油正交试验结果分析表

2.1.3 验证实验

按照正交试验优选出的最佳组合方案做3组平行试验，取其平均值，食凉茶挥发油提取率为1.95%。

2.2 食凉茶挥发油体外抗白色念珠菌效果

刃天青法检测挥发油对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC），是以刃天青作为指示剂，通过观察孔内颜色，判断食凉茶挥发油的抑菌活性。活菌新陈代谢的产生，使刃天青指示剂由蓝色变为粉红色，而死菌则不能。表2是加入刃天青后各孔颜色显示情况，通过对比可以发现，食凉茶挥发油对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）为6.25 mg/mL。将1～4孔的菌药混合物涂布培养后显示，第4孔有白色念珠菌单菌落长出，而从1～3孔中取出的混合液没有长出白色念珠菌，故最低杀菌浓度（MBC）为12.5 mg/mL。

3 讨论

食凉茶作为畲族常用药材，历史悠久，疗效多样，在药用、保健等方面具有较好的开发利用价值。挥发油是食凉茶的主要成分之一，近年来，对该类物质的研究也有很多，目前已知食凉茶在抗菌等方面具有良好的生物活性，但相关研究主要集中于抗细菌感染，未见抗真菌感染的研究报道，因此，笔者在此基础上对其抗真菌作用展开相关研究，以完善食凉茶的抗菌作用。

挥发油作为食凉茶的主要成分之一，含有许多具有药理活性的有效物质，食凉茶挥发油质量的稳定，是其药理活性的保证，因此对其挥发油提取工艺的研究具有重要价值。本实验结果表明，提取时间、料液比、浸泡时间对食凉茶挥发油的提取率均有影响，其中浸泡时间对挥发油提取率的影响最大，料液比其次，最后是提取时间，这可能与食凉茶日常饮用方式有关，浸泡时间及料液比对其挥发性物质的溶出有较为密切的影响。

本实验采用刃天青法测得食凉茶挥发油对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）为6.25 mg/mL，最小杀菌浓度为12.5 mg/mL。通过观察各孔颜色发现，在加入刃天青后，最低抑菌浓度（即未变红的孔）会随培养时间的延长向高浓度推移，这与李宙阳[15]等人研究结果一致，但达到上述浓度后孔内颜色能维持较长时间不再变化，说明该实验结果有效。

4 结语

综上所述，食凉茶挥发油的优化提取条件为：提取时间2.0 h，浸泡时间2.5 h，料液比1:10，在此条件下食凉茶挥发油的提取率为1.95%。通过实验证明食凉茶挥发油对白色念珠菌体内体外均有抑制效果，食凉茶挥发油对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）为 6.25 mg/mL，最小杀菌浓度（MBC）为12.5 mg/mL。本研究为食凉茶挥发油药物的应用提供理论基础，并为更多真菌感染的治疗提供参考。

表2 刃天青法测MIC中颜色与药物浓度的对应关系