不同益生元对酸奶游离氨基酸及风味的影响

李 蕊，王一然，刘一鸣，史海粟，陈 旭，赵瑛博，武俊瑞

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

酸奶因含有丰富的蛋白质、钙、核黄素、VB6和VB12，被认为比牛奶具有更多的营养价值[1]。随着人们生活水平及健康意识的提高，益生菌及益生元逐渐被用于酸奶发酵。益生菌使酸奶具有特殊的风味，提高营养价值，同时具有控制血清胆固醇水平[2]、提高免疫力和预防癌症[3]的作用。随着科学技术的发展，植物乳杆菌[4]、瑞士乳杆菌[5]、副干酪乳杆菌[6]、干酪乳杆菌[7]等新型益生菌也逐渐被研发。

益生元是一种膳食补充剂，包括菊粉、低聚异麦芽糖、低聚木糖、低聚半乳糖等，与酸奶中添加的蔗糖不同，益生元可以改善宿主的健康[8]，促进肠道有益菌生长[9]，利于营养素的消化吸收[10]，增强免疫系统，预防肥胖和便秘[11]，降低肠道pH值，减少心血管疾病及癌症风险[12]，还可以增加钙和镁的吸收[13]，影响血糖水平并改善血浆脂质[14]。益生元对有益菌有增殖效果，菊粉能增加双歧杆菌的代谢活性[15]；低聚木糖和低聚异麦芽糖可以影响酸奶中乳酸菌的数量[16]。同时，益生元的添加对酸奶的品质、结构也存在一定的影响，菊粉可以使酸奶的结构更加稳定，增强酸奶的固体性质[17]，且不会对酸奶本身产生影响[18]。β-葡聚糖会减弱酸奶的凝胶程度，进而提高酸奶中益生菌的活力[19]。但益生元对酸奶风味的影响参差不一，菊粉具有类似蔗糖的甜味，可以提高产品的甜味[20]，而低聚果糖、低聚半乳糖等益生元会减弱酸奶的风味[21]。聚葡萄糖的添加会使酸奶产生不良风味，降低酸奶的接受度[22]，低聚异麦芽糖[23]、菊苣粉[24]会降低酸奶的口感。

益生元在酸奶中发挥有益作用，使其具有更广泛的研究空间与开发前景。目前，对于益生元酸奶的研究主要集中于理化性质、结构质地、益生菌及发酵菌种的影响，对酸奶游离氨基酸及风味的研究较少。不同益生元间分子质量、结构间存在差异，进而会对酸奶中游离氨基酸及风味产生不同影响。本实验以添加不同益生元发酵的酸奶为研究对象，除检测蛋白质、脂肪等基本营养成分外，对不同种益生元发酵酸奶的游离氨基酸种类及含量进行检测，同时对酸奶中游离氨基酸与整体风味间的联系进行分析，旨在揭示添加不同益生元对工业化发酵酸奶中游离氨基酸和风味的影响，为益生菌酸奶的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料乳为市售纯牛奶。

嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌 法国Danisco公司；低聚木糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、蔗糖山东龙力生物科技股份有限公司；电子舌内部溶液、参比溶液、阴、阳离子溶液 日本Insent公司。

1.2 仪器与设备

120 乳品综合成分指标分析仪 美国Flowserve公司；5424R高速台式离心机 德国艾本德股份公司；SA402B电子舌 日本Insent公司；L-8900高效氨基酸分析仪日本日立公司；超高效液相色谱-串联飞行时间质谱系统美国AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 添加不同益生元酸奶样品的制备

以保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌1∶1混合作为发酵剂，以添加5%蔗糖、42 ℃发酵的酸奶为对照组，为保证实验结果的可靠性，同等条件下酸奶制备重复3 次，制备过程如下：

1.3.2 酸奶中基本营养成分含量测定

采用120乳品综合成分指标分析仪进行测定，实验均重复3 次。

1.3.3 电子舌味感的测定

利用电化学传感器，通过测定液体样本的综合味觉信息，对被测试样进行定量和定性分析。实验取适量体积酸奶进行测定，包括酸、苦、涩、咸、鲜及味感的丰富度。

1.3.4 添加不同益生元酸奶中游离氨基酸含量的测定

1.3.4.1 酸奶样品的前处理

根据Mayer等[25]的方法稍作修改，取待测酸奶样品加入5%磺基水杨酸混匀，离心后静置过膜，装入上样瓶备用。

1.3.4.2 色谱条件

分析柱（4.6 mm×60 mm，3 μm），柱温57.0 ℃，反应柱温度135 ℃，泵1流速0.45 mL/min，泵2流速0.35 mL/min，进样量20 μL。紫外检测器：脯氨酸在波长440 nm处测定吸光度，其他氨基酸在波长570 nm处测定吸光度。为保证实验结果可靠性，实验重复3 次。

1.3.4.3 游离氨基酸含量的计算

式中：Ci为游离氨基酸质量浓度/（ng/mL）；V为样品体积/mL；F为稀释倍数；M为氨基酸摩尔质量/（g/mol）；m为酸奶质量/mg。

1.3.5 营养评价

根据联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organation，FAO）/世界卫生组织（World Health Organation，WHO）最佳配比模式进行营养评价，即氨基酸评分（amino acid score，AAS），按式（2）计算：

1.4 数据统计分析

采用SPSS 22.0进行数据统计，采用单因素及相关性分析进行显著性分析；作图采用软件Origin 8.6和Sigma Plot 11。

2 结果与分析

2.1 不同益生元发酵酸奶中基本营养成分

添加不同益生元发酵酸奶，当酸度达到70 °T时，停止发酵，相较于对照组发酵时间4.5 h，添加益生元组发酵时间有所差异，其中低聚木糖组发酵时间为4 h，低聚半乳糖组为5.2 h，低聚异麦芽糖组为6 h。利用乳品综合成分指标分析仪对不同益生元发酵酸奶的基本营养成分进行测定，包括脂肪、蛋白质、总固形物、非脂乳固体含量，结果如表1所示。

表1 不同益生元发酵酸奶中基本营养成分质量分数Table 1 Contents of basic nutrients in yoghurts added with different probiotics%

发酵时间反映了不同益生元对酸奶中产酸菌株的作用存在差异，说明不同益生素的添加会影响酸奶中产酸菌株的活力，即低聚木糖可以提高保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌的活力，但低聚异麦芽糖及低聚半乳糖作用不明显，为益生元在酸奶工业化生产中的应用提供参考。

由表1可知，低聚异麦芽糖酸奶中总固形物和非脂乳固体质量分数最高，分别为16.02%、9.22%，低聚木糖酸奶中脂肪和蛋白质质量分数最高，分别为3.54%、3.11%。GB 19302—2010《发酵乳》规定蛋白质≥2.9%，脂肪≥3.1%，非脂乳固体≥8.1%，可以看出，添加不同益生元发酵酸奶的蛋白质含量、脂肪含量均符合国家标准。益生元的添加可以提高酸奶中营养物质含量，使酸奶的品质得到提升，且添加低聚木糖发酵的酸奶营养品质最好。

2.2 不同益生元发酵酸奶的电子舌味感分析

图1 不同益生元发酵酸奶电子舌雷达图Fig.1 Electronic tongue radar chart of yogurts added with different probiotics

从图1可以看出，添加不同益生元对酸奶的酸味有显著影响，从其酸味大小依次为：低聚木糖＜低聚半乳糖＜低聚异麦芽糖＜对照组。添加低聚异麦芽糖的酸奶涩味值显著小于其他组（P＜0.05），添加低聚异麦芽糖和低聚木糖的酸奶鲜味值显著大于对照组（P＜0.05），添加低聚异麦芽糖的酸奶甜味值显著大于对照组（P＜0.05），添加低聚木糖酸奶的苦味值显著大于其他组（P＜0.05）。综合得出，添加益生元可以降低酸奶的甜味，添加低聚异麦芽糖酸奶的口感要稍高于其他组别的酸奶。

2.3 不同益生元发酵酸奶中游离氨基酸含量

表2 添加不同益生元酸奶中游离氨基酸含量Table 2 Contents of free amino acids in yogurts added with different probiotics mg/g

由表2可知，从酸奶中共检测出17 种游离氨基酸，其中含8 种必需氨基酸。从整体看，添加低聚木糖酸奶中必需氨基酸含量最多，依次为低聚木糖＞对照组＞低聚异麦芽糖＞低聚半乳糖，且总氨基酸含量显著高于其他实验组及对照组（P＜0.05）。添加低聚异麦芽糖组和对照组中总氨基酸含量显著高于低聚半乳糖组（P＜0.05）。

此外，添加低聚木糖酸奶的Ser、Glu、Arg含量显著高于添加低聚半乳糖组（P＜0.05）；其中Thr、Val、Ile、Phe、Leu、Tyr等11 种氨基酸含量均高于对照组，且Leu、Tyr含量显著高于对照组（P＜0.05），Leu有助于调节血糖水平[26]，促进动物生长[27]；Tyr可被代谢成延胡索酸，参与三羧酸循环，为机体提供能量。此外，低聚木糖酸奶中Val、Ile和Leu含量均显著高于其他实验组（P＜0.05），当Val、Ile和Leu协同作用时，具有修复肌肉、控制血糖、提供能量的作用。

2.4 不同益生元发酵酸奶主成分分析

图2 添加不同益生元发酵酸奶的主成分分析得分图（A）和载荷图（B）Fig.2 PCA score plot (A) and loading plot (B) of yogurts added with different probiotics

由图2A可以看出，不同添加物发酵酸奶分布在不同区域，主成分存在较大差异，且4 组样品数据均分布在95%的置信区间内，说明添加不同益生元发酵酸奶与蔗糖发酵酸奶的游离氨基酸组分及含量存在很大差异，区分较为明显。可以看出，组间分离较为清楚，组内聚集性良好，分布结果比较理想，且相较于对照组，添加益生元实验组分布更为集中、均匀，说明样品重复性好，游离氨基酸含量较为稳定，进一步说明了添加益生元发酵酸奶均一性、稳定性良好，营养品质更为稳定。

由图2B可知，添加低聚木糖组Val、Ile、Leu等游离氨基酸含量较高，所以分布在PC1负方向。添加低聚异麦芽糖组和对照组His、Pro、Ala、Val、Asp、Ser等游离氨基酸含量较高，所以分布在PC2正方向。而添加低聚半乳糖组游离氨基酸含量相较于其他组略低，所以PC1正方向与PC2负方向重叠区域无氨基酸出现。可以体现出，正是不同游离氨基酸含量及配比导致了添加不同益生元发酵酸奶样品之间的差异。

2.5 呈味特征分析

氨基酸可分为鲜味、甜味、苦味和无味，鲜味氨基酸有Asp和Glu；甜味氨基酸有Thr、Ser、Gly和Ala[28]；苦味氨基酸有His、Phe、Ile、Leu、Tyr、Val、Met和Arg；无味氨基酸有Cys、Lys和Pro。添加不同益生元发酵酸奶的呈味氨基酸含量如图3所示。

图3 添加不同益生元发酵酸奶呈味氨基酸含量Fig.3 Contents of taste amino acids in yogurts with different probiotics added

由图3可知，各组间呈味氨基酸含量存在显著差异，其中，添加低聚木糖组鲜味、甜味、苦味氨基酸均显著高于其他组（P＜0.05），且鲜味与苦味的含量与其他组差异较为明显，印证了图1中添加低聚木糖组鲜味苦味均大于其他组的结果；而图3所显示甜味氨基酸含量的结果与图1结果有所差异，分析原因在于甜味氨基酸含量在总氨基酸含量中所占比重较小，导致作用效果不够明显。添加低聚异麦芽糖组鲜味显著高于对照组（P＜0.05）。添加低聚半乳糖组各呈味氨基酸均小于其他实验组及对照组。

2.6 滋味活性值（taste active value，TAV）分析

各种游离氨基酸体现出不同的呈味特征，是由于呈味物质含量及其味道阈值有所不同。TAV是各呈味物质在样品中的含量与其对应的味道阈值之比。通常认为，当TAV大于1时，该物质对样品的滋味有影响[29]。根据表2添加不同益生元发酵酸奶中各游离氨基酸含量及表3味道阈值，分析得到各游离氨基酸在添加不同益生元组分中的TAV，结果如表3所示。

由表3可知，添加低聚异麦芽糖组有15 种氨基酸TAV大于1，添加低聚木糖组次之，有14 种，添加低聚半乳糖组与对照组最少，有13 种。添加低聚木糖组中，对其味道有特别贡献的为Val、Ile和Phe，均为苦味氨基酸，其TAV分别为20.20、9.36和7.41。均高于其他品种，进一步印证了图1添加低聚木糖组鲜味苦味均大于其他组的结果。对照组中，对其味道有特别贡献的为His、Ala，分别为苦味氨基酸和甜味氨基酸。总体来看，各实验组Val、Phe、Ile、Arg和His对苦味贡献较大，Glu对鲜味贡献较大，Ala对甜味贡献较大。Met和Tyr对风味整体没有贡献，其余各氨基酸对酸奶风味影响大小依次为：Glu＞His＞Val＞Lys＞Ala＞Arg＞Ile＞Phe＞Pro＞Ser＞Leu＞Gly＞Asp＞Thr＞Cys。

表3 不同益生元发酵酸奶游离氨基酸TAVTable 3 TAV of free amino acids in yogurts added with different probiotics

表4 添加不同益生元发酵酸奶游离氨基酸与味感相关性分析Table 4 Correlation analysis between free amino acids and taste characteristics of yoghurts added with different probiotics

2.7 不同营养素发酵酸奶相关性分析

由表4可知，Ile、Val、Leu、Phe均为苦味氨基酸，Ile、Val呈显著正相关，Leu和Ile呈极显著正相关，苦味与Phe呈极显著正相关；Glu、Asp为鲜味氨基酸，Ser、Thr为甜味氨基酸，Glu与Ser呈显著正相关，鲜味与Thr呈显著正相关，甜味与Asp呈极显著正相关，这3 组关系相互印证了鲜味氨基酸与甜味氨基酸显著相关。Tyr为苦味氨基酸，酸味与Tyr呈显著负相关，这与图1中对照组酸味大、苦味小以及添加低聚木糖组苦味大、酸味小的结果吻合，同时验证了Tseng等[30]对氨基酸滋味的特征描述。

2.8 营养评价

表5 添加不同益生元发酵酸奶的AASTable 5 Amino acid scores of yoghurts with different probiotics added

FAO/WHO推荐的氨基酸模式中人体的各AAS分别为Ile 4.0、Leu 7.0、Lys 5.5、Met＋Cys 3.5、Phe＋Tyr 6.0、Thr 4.0、Val 5.0，由表5可知，Ile、Lys、Phe＋Tyr、Thr、Val的AAS均高于模式谱标准值，且添加低聚木糖组最高。添加低聚木糖组和对照组Leu的AAS高于模式谱标准值，Met＋Cys的各实验组均未达到氨基酸模式谱标准值。越接近氨基酸模式，即营养价值越均衡，因此，可以看出实验样品营养价值不够均衡，但作为人体主要限制氨基酸之一的赖氨酸评分值较高，且添加低聚木糖组最高。

3 结 论

添加不同益生元对酸奶中发酵菌株、氨基酸含量及风味存在不同程度的影响。其中，各实验组的基本营养成分均达到国家标准，低聚木糖可以提高保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌活力；不同组分电子舌味感结果有所不同，对酸味影响最大；低聚木糖的添加可以提高Leu、Tyr、Ile、Val、Ser、Glu和Arg的含量；各实验组主成分间存在较大差异；结合相关性分析发现，鲜味、甜味氨基酸呈显著正相关；添加低聚木糖组的AAS最高，且作为人体主要限制氨基酸之一的Lys评分值最高。因此，添加低聚木糖发酵的酸奶风味更好，营养价值更高，具有更好的益生作用。为其后续的风味研究及产品的开发生产利用了提供理论依据。