高迁移率族蛋白B1在伴有神经浸润胃癌组织中的表达及意义

拓婷，朱飞虎

延安市人民医院肛肠科，陕西 延安 716000

胃癌是临床上消化道肿瘤中最常见的类型，调查显示胃癌的年发生率为138.6/10 万，且其病死率在所有癌症致死病因中仅次于呼吸系统恶性肿瘤而居第2位[1]。胃癌的临床特点包括发病率及转移率高、病死率高，早期诊断率低等，其治疗效果不佳也多与转移率高关系密切[2]。神经浸润(PNI)目前被认为是一种新的肿瘤转移途径，是指肿瘤周围神经被侵及、包绕，或者瘤细胞直接进入到神经纤维间隙，从而造成肿瘤的转移扩散[3]。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)是一种仅合成或表达于增殖细胞中的核内多肽，既往临床重多重视其在炎症反应中的作用，现在认识到其在多种肿瘤组织尤其是转移瘤中具有高表达的特点，可通过促进肿瘤细胞侵袭迁移而引起肿瘤的转移、进展[4]。目前关于胃癌PNI 与HMGB1 关系的临床研究尚不多见，因此本研究分析了HMGB1在伴有PNI的胃癌组织中的表达及临床意义，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析延安市人民医院2017 年 2 月至 2019 年 2 月期间收治的 82 例胃癌患者的临床资料。纳入标准：①年龄≥18 岁；②术前均经病理检查证实为胃癌，术后病理进一步证实；③术前未接受放化疗及生物免疫等手段治疗；④临床及病理资料完整。排除标淮：①合并严重的免疫系统疾病以及长期应用免疫抑制剂治疗者；②合并其他脏器、系统的严重病变，或其合并其他恶性肿瘤者。82例患者中男性49例，女性33例；年龄52～84岁，平均(64.1±10.2)岁。

1.2 研究方法 所有患者均接受胃癌根治术治疗，收集患者的临床及病理资料，根据术后病理结果将伴有PNI 的38 例患者纳入观察组，余44 例未伴有PNI 者纳入对照组。比较两组患者的性别、年龄、饮酒、吸烟以及高血压、糖尿病等临床资料。饮酒标准：饮酒史＞3 年，≥100 mL/d；吸烟标准:吸烟史＞5年，≥20支/d。同时测定所有患者的胃癌组织HMGB1的表达，对PNI胃癌患者再次分组，根据HMGB1表达是否阳性将患者分别纳入阳性组和阴性组，比较两组患者的性别、年龄、临床分期及肿瘤大小、临床分期、是否有淋巴结转移等临床和病理特征。其中临床分期的依据为国际抗癌联盟TNM分期标准。

1.3 HMGB1表达的测定

1.3.1 免疫组织化学方法 手术结束后将胃癌组织送检病理科，制备石蜡切片，进行免疫组化染色。采用Envision 两步法，阴性对照选择磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗。首先将石蜡包埋的组织进行4 μm的连续切片；使用二甲苯脱蜡，再使用梯度酒精进行逐级水化；将其放置在3%双氧水、甲醇室温下予以作用30 min，以阻断内源性过氧化物酶活性；然后使用乙二胺四乙酸缓冲液进行抗原热修复，时间为90 s；加入一抗HMGB1，放置在4℃条件下孵育过夜，使用PBS 充分冲洗；加入Envision 二抗，在室温下孵育30 min；在光镜下用二氨基联苯胺(DAB)进行显色，苏木精复染、脱水、风干及封片等步骤，封片材料为中性树脂。其中鼠单克隆抗体HMGB1 由北京博奥森生物技术有限公司提供，二抗、DAB、PBS等试剂由福州迈新公司提供。

1.3.2 阳性结果的判读 HMGB1蛋白阳性表现为显微镜下细胞核或者细胞质内呈现呈棕色，观察显色癌细胞比例和染色强度，然后进行半定量化评分，标准：肿瘤组织内未发现棕色染色组织，或≤10%细胞膜/浆/核染色时判定为(-)；肿瘤组织出现＞10%细胞膜/浆/核部分染色，则判断为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS19.0 统计学软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间均数比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组患者的临床资料比较 观察组和对照组患者在性别、年龄、饮酒、吸烟及合并高血压方面比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；但是观察组患者合并糖尿病的比例明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 观察组和对照组患者的临床病理资料比较

2.2 观察组和对照组患者的HMGB1表达水平比较 HMGB1蛋白表达在显微镜下细胞质或细胞核内呈现棕色见图1 和图2。观察组中有28 例HMGB1 表达阳性，阳性率为73.68%，明显高于对照组的47.73%(21/44)，差异具有统计学意义(χ2=5.173，P＜0.05)。

图1 细胞质中HMGB1的表达（×200）

图2 细胞核中HMGB1的表达（×200）

2.3 观察组患者HMGB1表达与临床病理指标的关系 观察组患者中，HMGB1阳性组与阴性组的年龄、性别比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；但是阳性组患者肿瘤直径≥3 cm、TNM Ⅲ～Ⅳ、淋巴结转移的比例明显高于阴性组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 观察组患者HMGB1表达与临床病理指标的关系

3 讨论

胃癌在我国是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病率出现逐年上升的趋势，已经成为威胁我国居民健康及生命安全的重要疾病[5]。胃癌患者早期常常缺乏典型临床症状，一旦发病则出现快速进展，患者就诊时常常处于中晚期[6-7]。近些年来，恶性肿瘤神经浸润的机制及意义不断被深入研究，临床上也越来越重视PNI 在恶性肿瘤中的重要意义[8]。目前研究认为PNI 是恶性肿瘤的一种新的转移方式，可能独立于既往的血道转移、淋巴转移、种植转移以及直接转移，且与恶性肿瘤的预后关系密切。目前胃癌PNI的具体机制尚不明确，但是研究指出合并PNI 的胃癌患者其预后更差[9]。周乐盈等[10]对413 例胃癌患者的临床资料并进行回顾性分析，指出神经浸润与肿瘤的进展密切相关，对胃癌患者预后评估有着重要的作用。本研究对比了合并PNI的观察组与未合并PNI的对照组的临床资料，发现观察组合并糖尿病的比例明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。既胃癌PNI 的发生与年龄、性别及饮酒、吸烟、高血压等因素无明显的相关性，但是糖尿病与PNI的发生可能存在关联，说明胃癌患者如合并糖尿病则增大了其发生神经浸润的风险。分析其原因可能是因为糖尿病患者长期存在高血糖状态加重了其神经病变，进而导致了神经浸润的发生，患者也更容易发生PNI[11]。

高迁移率族蛋白B1常位于真核生物的细胞核内，是一种生物学功能多样的核内蛋白。既往认为HMGB1 在细胞外具有强大的致炎效应，且被认为是新型的炎性细胞因子之一[12]。随着对HMGB1研究的深入，发现HMGB1 在核内主要与DNA 结合，不仅可以起到稳定核小体结构的作用，还与DNA的一系列生命活动关系密切如参与重组、修复、调控等[13]。此外，HMGB1 与肿瘤关系密切，通过结合不同受体可以发挥不同作用如促进基质降解、诱发新生血管形成、调节神经轴突生长能力等，进而促进肿瘤的发生、发展以及肿瘤的转移等过程[14-15]。既往有研究指出，HMGB1 与肝癌者的临床分期、分级密切相关[16]。CHUANG 等[17]观察了胃癌患者血清HMGB1 浓度与临床与病理指标的关系，发现患者血清HMGB1 水平与胃癌肿块大小、淋巴结转移及患者的预后均存在显著的相关性。在本研究中，观察组胃癌组织HMGB1的阳性表达率为73.68%，明显高于对照组的47.73%，差异有统计学意义(P＜0.05)。另一方面，在伴有PNI胃癌中，HMGB1 阳性组与阴性组比较，年龄、性别差异无统计学意义(P＞0.05)；但是阳性组其肿瘤直径≥3 cm、TNM Ⅲ～Ⅳ、淋巴结转移的比例均明显高于阴性组，差异有统计学意义(P＜0.05)，这进一步提示HMGB1可能参与了胃癌PNI的发生与发展。

综上所述，合并糖尿病的胃癌患者可能更容易发生神经浸润；而神经浸润胃癌组织中HMGB1 的表达高于未伴有PNI的胃癌组织，且其与肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移关系密切，有望成为胃癌的靶向治疗及预后评估中的新的指标。