微生物降解昭通褐煤提高游离腐殖酸含量

程娟 何环 衡曦彤 赵阳 刘健 石开仪 曹清河 李成果

摘要：筛选到1株对云南省昭通褐煤降解效果较好的菌株H3，经分子生物学鉴定，该菌株与青霉菌Penicillium griseopurpureum的相似度为96%。通过正交试验筛选H3菌株生物降解昭通褐煤产游离腐殖酸的主要影响因素，结果表明，煤样粒度会明显影响H3菌株对煤的生物降解，并且当粒度小于0.074 mm、反应温度为30 ℃、反应时间为7 d时，菌株H3对褐煤的降解效果最好，经降解后褐煤中游离腐殖酸含量为70.34%，提高35.87%，降解率达到56.25%。通过工业分析、X射线衍射仪（XRD）、傅里叶红外光谱仪（FT-IR）分析了微生物降解前后褐煤性质的变化，结果表明经H3菌株降解后昭通褐煤的水分和固定碳含量略有上升，而挥发分和灰分含量略有下降，煤中一部分芳香环可能被真菌破坏，使其微晶结构发生变化。同时，经过微生物降解后的褐煤，部分碳碳双键和碳氮单键消失，说明原煤部分官能团被破坏。

关键词：褐煤;生物降解;游离腐殖酸;青霉菌;降解工艺优化

中图分类号： TQ536;S182  文献标志碼： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0296-06

我国煤炭资源较丰富，其中低阶煤含量占煤炭总储备量的50%，低阶煤包含褐煤、长焰煤、弱黏煤、不黏煤、气煤、焦煤等[1]。目前，直接燃烧利用低阶煤存在严重的能效和环境问题，因此实现低阶煤的清洁高效利用意义重大。低阶煤是一种富含腐殖酸的资源，其中腐殖酸的含量为10%～80%，从中提取的腐殖酸具有较高的生化活性，属于高附加值产品，目前已在农业、工业、医药卫生、环境保护、炭材料制备等领域中广泛应用[2-3]。提取低阶煤腐殖酸所用的传统化学方法污染大、成本高。

生物技术方法是一种环境友好型办法，近年来利用微生物降解煤获取腐殖酸的方法应用也越来越广泛[3]。Can等利用RBK 7细菌菌株对哈萨克斯坦褐煤进行降解，从中提取了腐殖酸并应用于香菜种植，发现提取的腐殖酸对土壤肥力和发芽率有改善作用[4]。Yang等采用Penicillium decumbens P6纯化酯酶降解褐煤，结果表明酯酶对褐煤有解聚作用，可产生腐殖酸[5]。Miszkiewicz等利用尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）1101菌株降解氧化剂预处理的褐煤，结果显示尖孢镰刀菌1101菌株能够提高褐煤的液化程度和游离腐殖酸含量[6]。

煤种、菌种的选择及匹配情况是影响微生物降解煤效果的重要因素;除此之外，在煤和菌种确定的情况下，微生物降解煤的主要影响因素有煤粒度、菌接种量、溶煤时间、溶煤温度、环境温度等[7-8]。Kang等采用4种细菌对神木褐煤进行了生物降解试验，通过单因素试验、正交试验，得到最佳条件下煤的生物降解率可达53.6%[9]。Sabar等从巴基斯坦低阶煤样品中分离得到1株真菌（AD-1菌株），对AD-1菌株介导的煤降解反应进行优化，表明AD-1菌株在1.5%葡萄糖和0.5%加煤率的条件下培养11 d可以释放出煤样中大量的有机物[10]。尹艳通过正交试验优化了多黏类芽孢杆菌降解褐煤的工艺条件，得到煤样粒度、菌液用量、降解时间、煤浆浓度等各因素的最优水平[11]。

腐殖酸按照存在形态可分为游离腐殖酸和（钙、镁）结合腐殖酸[12]。结合态腐殖酸生物活性较低，在农业等领域中无法直接应用，只有游离腐殖酸才具有固氮、解磷、释钾的良好作用[13]，因此提高煤质腐殖酸中水溶性游离腐殖酸含量有着重要意义。云南省昭通市褐煤储存量很丰富，其中所含的煤质腐殖酸资源有待利用。本研究从云南省昭通市褐煤煤田周边土壤中分离菌种，筛选出对褐煤有较好液化效果的真菌进行分子生物学鉴定，然后通过正交试验优化影响生物降解试验的因素，并对褐煤降解前后进行物化性质分析，以期为该地区褐煤资源的利用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 真菌的筛选鉴定

本试验采用的褐煤样品来源于云南省昭通市的露天褐煤，其中总腐殖酸、游离腐殖酸含量分别为37.55%、34.47%。从取回昭通褐煤样品中分离真菌，将分离得到的真菌利用孟加拉红琼脂培养基[14]培养，菌种长满平板后，在菌体表面均匀地撒上0.3 g褐煤样品，将平板倒置，于28 ℃培养箱中培养，每隔24 h观察1次微生物对煤的降解情况。采用真菌DNA抽提试剂盒（HP Fungal DNA Kit，产品编号为D3195，OMEGA公司）提取真菌DNA，进行聚合酶链式反应（PCR）扩增。扩增条件：95 ℃变性 10 min;94 ℃变性30 s，57 ℃ 复性30 s，72 ℃延伸 60 s，30个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增后产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将胶回收试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]切胶纯化的PCR产物送至广州赛哲生物科技股份有限公司测序。将菌株的基因序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI）网中GenBank序列数据库进行比较，选取与之同源性最高的5种菌株的基因序列，采用MEGA 7.0软件构建系统发育树，比较其序列同源性。

1.2 褐煤生物降解条件优化

根据前期单因素试验的结果采用正交试验进一步筛选昭通褐煤降解的最优条件。选用培养48 h的菌种进行平板溶煤试验，设置煤样粒度（A）、反应温度（B）、反应时间（C）等3个影响因素，每个因素分别设置3个水平，不考虑各因素的交互作用[15-16]。如表1、表2所示，正交试验采用L9（34）正交表。测定反应前后褐煤的降解率、游离腐殖酸含量，根据GB/T 35107—2017《矿物源腐殖酸肥料中可溶性腐殖酸含量的测定》[17]测定褐煤中游离腐殖酸的含量，降解率（η）的计算方法如下：

使用直径为15 cm的大平板，将菌种划线培养72 h后，菌丝布满整个平板，撒入0.8 g不同粒径的干燥褐煤煤样，分别放在28、30、35 ℃的恒温培养箱中，按正交试验设计要求反应3、5、7 d。反应结束后，用去离子水冲洗掉平板上残留的煤样，冲洗液于10 000 r/min条件下离心10 min，随后收集沉淀物，于70 ℃恒温箱中干燥至恒质量，分析褐煤的降解率和游离腐殖酸含量。

1.3 褐煤生物降解前后理化性质的分析

用去离子水将平板上生物降解后的残煤冲洗下来，在10 000 r/min条件下离心10 min，将离心管中的沉淀物于100 ℃干燥3 h后收集样品。将原煤和残煤样品研磨至粒度为75 μm，制备好煤样送至江苏地质矿产设计研究院进行工业分析。煤样研磨至粒度为 48 μm，于105 ℃真空干燥2 h，采用德国布鲁克公司D8 Advance型X射线衍射（XRD）仪分析原煤和降解后残煤矿物组成;将样品与溴化钾粉按质量比1 ∶ 120的比例混合，研磨成片剂样品，采用德国布鲁克公司VERTEX 80 V型傅立叶变换红外光谱仪（FT-IR）对原煤和残煤样品进行分析，扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描32次[18]。

2 结果与分析

2.1 真菌的筛选鉴定

从昭通褐煤中分离出H3菌株，将倒置平板于30 ℃恒温培养箱培养72 h后加煤培养，观察结果如图1所示。H3菌株菌落呈乳白色，菌丝不断扩大直到覆盖整个培养皿，生长后期变成暗绿色。待菌落长满培养皿，均匀撒入0.3 g褐煤煤样（煤样过200目筛，于70 ℃烘箱中干燥3 h预处理），72 h后观察褐煤降解情况，可以看到菌株生长状况良好，其中H3菌株平板上出现了明显的液滴（如图1-b中箭头所示），说明该菌株对昭通褐煤具有降解效果。

对H3菌株进行分子生物学鉴定，利用PCR扩增ITS区域，测序后与GenBank中的已知序列进行对比，结果如图2所示，H3菌株与Penicillium griseopurpureum的部分序列相似率为96%，期望值为0，与原物种序列相似度为99%，由此可以确定H3菌株为青霉属真菌。

2.2 正交试验

由表3、表4分析可知，试验结果的影响因素表现为A>C>B，即煤样粒度对该试验影响最大，其次为反应时间，反应温度影响最小。在试验条件下A、B、C 3个因素的最优水平组合为A3B2C3，即煤样粒度小于0.074 mm、反应温度为 30 ℃、反应天数为7 d，在该条件下经降解后褐煤中游离腐殖酸含量为70.34%，相较原煤（据“1.2”节测得原煤中游离腐殖酸的含量为34.47%）提高35.87%，降解率达到56.25%。

煤样粒度为0.150～0.500 mm、0.074～0.150 mm 时，反应产生的游离腐殖酸含量基本相同，在煤样粒度小于0.074 mm时，游离腐殖酸含量大幅增加;煤样粒度越小，煤样与菌丝体接触的面积就越大，更容易与煤反应，加速降解作用，产生腐殖酸[19]。由观察结果可知，游离腐殖酸含量随着温度上升而下降，笔者推测28 ℃可能是H3菌株的最佳生长温度，因此在28 ℃时降解效果最佳，随着温度升高降解效果减弱。降解时间达到7 d，游离腐殖酸含量相比之前最高，表明随着降解时间增长，游离腐殖酸含量不断提高，提高幅度逐渐减少，可能随着时间的延长培养基内营养物质不足，从而无法满足菌体降解煤的需要[20]。

2.3 生物降解前后煤的物化性质

对褐煤原煤以及最佳试验条件处理后的残煤进行工业分析，如表5所示，反应后褐煤的灰分和挥发分含量都有所降低，固定碳含量增加，说明微生物会降解煤产生一部分腐殖酸碳，从而使固定碳含量增加。

如图3所示，反应前后峰的位置没有变化，说明其矿物组成无明显变化，但是反应后的峰强度变化较大，据Jiang等的研究[21]可初步判定褐煤经过降解后，结晶度变高。从表6可以看出，反应前后褐煤的片层间距从0.171 8 nm增加至0.172 3 nm，增加的数值很小，基本不变;反应前后的层片堆砌厚度（Lc）从原来的 1.087 6 nm 上升至1.116 9 nm，层片原来的2.129 nm转变为2.186 nm，La随煤化程度的增加而增大。综上所述，褐煤降解前后煤的微晶结构的变化可能是微生物降解过程中降解平均堆砌厚度增高，Lc为1.2 nm时，芳香层片的堆砌层数为3～4层，反应前后的层片直径（La）由了一部分芳香环，使其微晶结构发生变化[22-23]。

如图4、表7所示，结合Choudhury等的研究[24-25]对比反应前后褐煤的FT-IR分析结果可知，褐煤降解前后出峰的位置基本未发生变化。其中，原煤中碳碳双键吸收峰消失，可能是在微生物转化过程中双键断裂，结合氧生成了C—O等含氧官能团;原煤仲酰胺的C—N吸收峰消失，也说明降解后的褐煤部分官能团被破坏[26-28]，证明H3菌株对褐煤有一定的降解作用。

3 结论

本研究分离鉴定了1株对云南昭通褐煤有降解效果的菌株H3，采用正交试验对H3菌株降解褐煤的工艺参数进行了优化并对降解前后煤的物化性质进行了分析，得到结论如下：

（1）菌株H3在固體平板上菌落呈乳白色，生长后期菌丝变绿，系统发育分析结果表明该菌株与Penicillium griseopurpureum序列相似率为96%，因此将其命名为Penicillium griseopurpureum H3，固体平板溶煤试验结果表明该菌株对褐煤具有较好的降解效果。

（2）正交试验结果表明菌株降解褐煤产生游离腐殖酸的最佳条件为煤样粒度小于0.074 mm、反应温度为30 ℃、反应时间为7 d，在该条件下褐煤中游离腐殖酸含量为70.34%，提高35.87%，降解率达到56.25%。

（3）经菌株H3降解后褐煤的灰分和挥发分含量都降低，固定碳含量增加，在降解过程中产生了一部分芳香环，使得其微晶结构发生变化。同时，经过微生物转化后的褐煤，碳碳双键和碳氮单键消失，证明原煤部分官能团被破坏。

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