高效液相色谱-串联质谱法检测原桃胶中左旋肉碱的含量

刘启月 李勇 余向阳 胡秋辉

摘要：利用超声波辅助提取技术和高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对原桃胶中的左旋肉碱进行定量分析。以左旋肉碱的含量为研究对象，考察不同提取剂的提取效率，优化左旋肉碱的液质联用分析条件。结果表明，1 g原桃胶经80%甲醇于60 ℃、300 W超声提取1 h处理的左旋肉碱得率最高;左旋肉碱在相应含量范围内的线性良好，r2=0.995;左旋肉碱加标量为140～560 μg/kg时，回收率为89.7%～109.9%，相对标准偏差为1.4%～4.5%，方法定量限为15.1 pg。利用建立的分析方法测定6批桃胶样品中的左旋肉碱，结果显示，得率为 160～330 μg/kg。综上可得，该方法可准确快速地对桃胶中的左旋肉碱进行定量分析。

关键词：原桃胶;左旋肉碱;液质联用;LC-MS/MS

中图分类号： R284.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0215-04

桃胶别称桃树胶，是桃[Prunus persica （L.） Batsch]或山桃[Prunus davidiana（Carr.）Franch]等蔷薇科植物树干受到机械伤或致病后分泌出来的胶质半透明状物质[1]在树干上晒干或采用其他脱水方法获得的淡黄色、黄褐色半透明的固体块状物质（图1）。采摘后未经其他加工处理的桃胶为原桃胶，原桃胶味苦、性平、益气、和血、止渴、活血消肿、通淋止痛[2]。古代早已记载，原桃胶具有治疗消渴症即糖尿病的作用[2-4]，现代研究也发现，原桃胶具有降血糖、降血脂、提高免疫力[5]、抗氧化[6]、抗菌[7]等功能。并不是所有的桃树都能产生桃胶，一般新树不产生桃胶，随着树龄的增长，树枝上的干创口（生理或病理）增多，流胶开始变多。桃胶的产生与气候有很大关系，在我国亚热带季风气候区的沿海沿江地区，夏秋季桃胶的生产量较多，尤以湖北、浙江、福建、江苏秦岭-淮河以南地区盛产。盛产桃胶地区的居民常将桃胶作为一种食材烹饪成各种地方特色美食食用，例如用桃胶煲羹，有土家燕窝之称，一度被很多爱美人士追捧。

左旋肉碱（L-carnitine），又称L-肉碱、左卡尼汀、L-肉毒碱或维生素BT，是一种人类必需的类氨基酸，其主要的生理功能是作为载体将长链脂肪酸从线粒体膜外运输到膜内，从而促进脂肪酸的 β-氧化，加速机体的脂肪代谢[8]。研究发现，适当增加人体内左旋肉碱的含量，可以促进脂酰基的转运，从而促进脂肪代谢，降低各种组织的脂肪量，达到减脂、减体质量的目的[9]。左旋肉碱具有很好的保健作用，常作为食品中的营养强化剂、添加剂添加于婴儿食品、运动员饮品、减肥健美食品中，还可以作为饲料添加剂促进动物生长[10]。人体内左旋肉碱的一个重要来源是从膳食中摄入，左旋肉碱在红肉中的含量较多，在植物中的含量极少甚至没有。目前，左旋肉碱的检测方法主要有酶技术法、高效液相色谱法（HPLC）、离子色谱法和质谱联用法[11]，其中质谱联用法操作方便，不需要衍生化，不存在衍生过程中的水解问题，并且液相色谱可以消除载体干扰因素，适合样品中游离肉碱、总肉碱的测定[12]。

目前，对于原桃胶的研究主要集中在桃胶多糖成分的分析及其功能研究，对其他成分的研究基本没有报道。原桃胶的营养价值不仅是因为其含有丰富的植物多糖，研究者在原桃胶中还发现了蛋白质、氨基酸及丰富的微量元素。笔者在试验前期发现，原桃胶中可能还存在左旋肉碱。原桃胶中的左旋肉碱含量可能是评价原桃胶营养价值的重要指标。本研究以原桃胶为原料，优化提取条件及液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）检测条件，对原桃胶中的左旋肉碱进行提取与定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1批原桃胶混合样品采摘于湖北省武汉市，6批不同品种的原桃胶样品于2019年6月采摘于浙江省杭州市;左旋肉碱标准品（纯度为95.54%，购自上海安谱实验科技股份有限公司）;超纯水（仪器购自Direct-R公司）;甲酸、甲酸铵、甲醇、乙腈均为色谱纯。

Agilent 1290-6470液相色谱质谱联用仪，购自美国Agilent公司;SBL-10DT超声波恒温清洗剂，购自宁波新芝生物科技股份有限公司;TG16-WS型高速离心机，购自长沙湘智离心机仪器有限公司;粉碎机，购自天津泰斯特检测有限公司;AP2500-0 型电子天平，产自瑞士Ohaus公司。

1.2 试验方法

1.2.1 左旋肉碱的提取方法 挑选100 g干净的食用级原桃胶，经粉碎机粉碎60 s后，将桃胶粉过60目筛收集备用。取1 g桃胶粉于50 mL离心管中，加入30颗玻璃小珠（防止桃胶样品结团，提高提取效率），加入10 mL提取液，在60 ℃温水中于300 W超声提取60 min，室温冷却至常温后 5 000 r/min 离心5 min，取1 mL上清液，用 0.22 μm 的有机滤膜过滤到进样小瓶中，待測。

1.2.2 标准液的制备 标准储备液的配制：称取10.0 mg左旋肉碱入10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后稀释定容、混匀。配制的左旋肉碱标准储备液质量浓度为1 mg/mL，可于-18 ℃保存6个月。

标准曲线的绘制：用甲醇将左旋肉碱标准储备液逐级稀释，得到质量浓度为10、20、40、60、80、100 μg/L 的标准液，根据测得的结果绘制标准曲线。

1.2.3 色谱条件 色谱柱Agilent poroshell 120 HILIC-Z（2.1 mm×150.0 mm，2.7 μm），Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150.0 mm，3.5 μm），流动相：80%乙腈-20%水（含20 mmol/L甲酸铵，用纯度为99%的甲酸调节pH值为2.3），流速为 0.3 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为5 μL。

1.2.4 质谱条件 离子监测方式为多离子监测（MRM），离子化模式为正离子化方式，离子源为电喷雾（ESI），毛细管电压为4.0 kV，雾化气压为103.4 kPa，干燥气流速为11 L/min，干燥器温度为350 ℃，定量离子对的质荷比（m/z）为162. 1→103.1，定性离子对的m/z为162.1→64.1，锥孔电压为100 V，碰撞能量为14 V，左旋肉碱在3 min左右即出峰。

2 结果与分析

2.1 LC-MS仪器条件的优化

左旋肉碱为极性化合物，本研究分别考察C18色谱柱、HILIC色谱柱的分离效果，以80%乙腈-20%水（20 mmol/L甲酸铵，pH值为2.3）为流动相，由于左旋肉碱的极性强，C18柱峰型不佳且拖尾现象明显，而HILIL柱对左旋肉碱的保留时间适中且峰形佳，适合定量分析。图2-a为C18柱左旋肉碱的提取离子EIC图，图2-B为HILIC色谱柱左旋肉碱的提取离子EIC离子图。左旋肉碱在电喷雾正离子化方式下主要生成[M+H]+（m/z：162.2），因此选择[M+H]+进行产物离子扫描，产生的主要碎片离子m/z为103.1和64.0，将m/z为103.1的碎片离子作为定量离子，将m/z为64.0的碎片离子作为定性离子。整个检测过程为5 min，出峰时间为 3 min 左右（图2）。

2.2 样品提取优化

考察用不同含水量的有机提取液提取桃胶中左旋肉碱的效率，取1 g混合样桃胶粉末，加入 10 mL 提取液，提取液分别为体积分数为90%、80%、70%乙醇、甲醇和乙腈，按照“1.2.1”节的方法超声提取1 h，取上清液，过滤后用LC-MS/MS测定其左旋肉碱含量。由图3可以看出， 80%甲醇的提取得率为9种提取液中最好的（当甲醇含水量大于30%时，桃胶泡发成黏稠状，无法分离上清）。因此，本研究选择80%甲醇提取左旋肉碱。

2.3 左旋肉碱的回收率与检出限

用80%甲醇按照“1.2.1”节的方法重复提取7份桃胶粉末，用LC-MS/MS测得左旋肉碱的均值为288 μg/kg，相对标准偏差（RSD）为4.9%。以288 μg/kg作为本底值，添加约0.5、1.0、2.0倍本底值的左旋肉碱标准物质到实际样品中，进行回收率试验，每个添加浓度平行重复5次。由表1可见，左旋肉碱的加标回收率为89.7%～109.9%，相对标准偏差为1.4%～4.5%。因此，本研究方法具有较好的回收率，能够满足实际样品的分析要求。

取储备液逐级稀释，进样量设为5 μL。以信噪比（S/N）=3计算左旋肉碱的检出限（LOD），以信噪比=10计算其定量限（LOQ），并以标准品的质量进行计算。结果表明，左旋肉碱的LOD为 5.0 pg/g，LOQ为15.1 pg/g，能够满足实际样品分析对检测限的需求。

2.4 标准曲线与线性范围

利用LC-MS/MS分析10、20、40、60、80、100 μg/L 系列标准溶液。以标准样品的峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（x，μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程为y=274.9x+815.8，r2=0.995。结果表明，在质量浓度为10～100 μg/L 范围内时，左旋肉碱的线性关系良好。

2.5 精密度与重现性

分别对质量浓度为10、20、100 μg/L的标准溶液进行5次连续进样，计算5次测定值的平均值和变异系数（CV），考察方法的精密度。由表2可见，针对不同浓度的左旋肉碱标准溶液进行连续进样后，3个质量浓度水平的CV为1.0%～3.1%，表明该方法随机误差较小，具有较好的精密度。通过同一台仪器、同一实验员同一天对定值配方粉进行重复测定（n=7），考察方法的日内精密度;通过同一台仪器、同一实验员连续3 d对定值配方粉进行重复测定（n=7），考察方法的日间精密度。结果显示，日内精密度和日间精密度良好，CV分别为3.2%和8.0%。

2.6 样品含量的测定

取6月份采集于浙江省的6批不同品种的桃胶样品，粉碎后分别准确称取1 g，每个样品设3个平行，分别按照“1.2.1”节的方法对桃胶中的左旋肉碱含量进行测定。如表3所示，经本研究方法对6批桃胶样品进行定量分析，确定该6批原桃胶中的左旋肉碱含量为160～330 μg/kg。左旋肉碱在动物红肉中含量丰富，在羊肉、牛肉中的含量较高，瑞士LONZA公司的数据显示，绵羊肉中的左旋肉碱含量达到2 100 mg/kg，牛肉中的含量为640 mg/kg，鸡肉中的含量为75 mg/kg。目前的研究结果显示，左旋肉碱在植物中含量很少或基本没有，在椰菜花、花生中的含量为1 mg/kg，橄榄、橙汁、菠菜叶中未检出左旋肉碱。原桃胶中左旋肉碱的含量尚达不到GB 14880—2012《食品安全国家标准——食品营养强化剂使用标准》[13]中的含量范围，但其作为一种膳食兼备的天然植物源产品，还是含有一定量的左旋肉碱。原桃胶中不只含有桃膠多糖，研究原桃胶中的其他具体功能活性成分，可为后期桃胶功能型产品的开发与加工提供指导性建议。

3 结论

本研究利用超声波辅助提取技术和高效液相色谱-串联质谱仪对原桃胶中的左旋肉碱进行定量分析。结果显示，1 g原桃胶经80%甲醇于 60 ℃、300 W超声提取1 h所得左旋肉碱得率最高。左旋肉碱在相应含量范围内的线性良好，r2=0.995，加标回收率和检测限定量限均满足要求。利用本研究建立的分析方法，测得6批桃胶样品中左旋肉碱的得率为160～330 μg/kg。

目前，评价桃胶的品质标准并不完善，还需从多方面做更详细的研究。一方面是应加大对其含量最多的桃胶多糖的生理作用机制的研究;另一方面，应加大对除桃胶多糖外其余的生理活性成分的定性定量研究;最后，桃胶作为采后可直接食用的食材，农药残留风险也是需要关注的重点。由此看出，原桃胶的价值研究需要投入更多关注。

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