南苜蓿叶总黄酮提取及抑菌抗氧化活性

王家皓 贲蕾洁 符茜 张扬 郑丽雪

摘要：以南苜蓿为原料，通过复合酶解协同乙醇法提取其叶片中的总黄酮。采用响应面分析法优化其最佳提取工艺，进一步考察南苜蓿叶总黄酮对大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制性能，再通过对羟基自由基的清除能力、DPPH自由基的清除能力测定其抗氧化性能。结果表明最佳提取工艺为：复合酶用量3.0%，酶解时间15.7 min，酶解温度39.0 ℃。在此条件下，南苜蓿叶总黄酮得率达到（1.9±0.3）%。抑菌试验结果表明，南苜蓿叶总黄酮对大肠杆菌ATCC 25922最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，简称MIC）为 0.15 mg/mL，对金黄色葡萄球菌ATCC 25923 MIC为0.20 mg/mL。南苜蓿葉总黄酮对羟基自由基和DPPH均表现出一定的清除能力，当样品浓度为1.0 mg/mL时，清除率分别为54.75%、88.48%，对DPPH自由基、羟自由基半数抑制浓度IC50分别为0.368、0.947 mg/mL。

关键词：南苜蓿;叶片;总黄酮;提取工艺;复合酶解法;抑菌活性;抗氧化活性;清除率;最低抑菌浓度;半数抑制浓度

中图分类号： TS201.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）17-0201-05

南苜蓿是豆科苜蓿属的一二年生草本植物，别称草头、金花菜，主要分布于我国江浙一带[1]。它在我国有悠久的栽培历史，最早作为绿肥和饲料引用栽培[2]。南苜蓿对生长环境要求不高，所以其产量很大，而且生长快速。南苜蓿具有清热凉血、治疗黄疸、降低胆固醇含量[3]等多种养生调理作用，营养价值极高，其嫩芽中蛋白质含量在28.5%以上，富含18种氨基酸以及丰富的维生素、矿物质、微量元素等，具有高蛋白、高膳食纤维、低脂肪特征，加之口感清爽、甘甜，广泛用于蔬菜食用[4]。

目前，针对南苜蓿的研究主要有3个方面：一是种质资源评价与遗传多样性研究[5-6];二是功能因子生理活性研究[7-8];三是化学成分提取鉴定。晏小云等从南苜蓿乙醇提取物中发现以芹菜素为代表的黄酮功能因子，但其生理作用机制尚不清楚，研究相对不够深入[1]。本研究首次采用复合酶解协同乙醇法提取南苜蓿叶（主要食用部位）中的总黄酮，在单因素试验基础上，采用响应面分析法对提取工艺进行优化，进一步分析其抗菌及抗氧化性能，为苏南地区南苜蓿资源的综合开发利用奠定一定的理论基础与试验数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

主要试验材料有南苜蓿（常熟当地10月产）、芸香苷标准品、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、果胶酶、纤维素酶、无水乙醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、磷酸盐缓冲液、绿矾（FeSO4·7H2O）、邻二氮菲、三氯乙酸、三氯化铁、抗坏血酸，均购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 仪器与设备

主要试验仪器有PL602E/02型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]、DHG-9037A型恒温干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）、HH-11-2-S型水浴锅（上海新苗医疗器械制造有限公司）、722-UV型紫外分光光度计（上海高致精密仪器有限公司）、HK-20B 1000g型粉碎机（广州市旭朗机械设备有限公司）、SHB-IIA型离心机（临海市永昊真空设备有限公司）。

1.3 试验菌种

试验菌种主要有大肠杆菌（Escherichia coli） ATCC 25922、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC 25923，菌种保藏于常熟理工学院生物与食品工程学院发酵工程中心。

1.4 培养基

LB培养基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g 氯化钠，1 L蒸馏水，pH值为7.2～7.4。

1.5 试验方法

1.5.1 南苜蓿预处理 将南苜蓿叶置于70 ℃烘箱内干燥至恒质量，取出用粉碎机粉碎，过20目筛网，得到南苜蓿叶粉末，用袋子密封好放在通风干燥处避光保藏，备用。

1.5.2 标准曲线的制备 参考余勇等的方法[8]制作芸香苷标准曲线。以芸香苷浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线。本试验中得到线性回归方程为y=12.595x-0.006 8，r2=0.998 7，表明在一定范围内吸光度与浓度的线性关系良好。

1.5.3 南苜蓿叶总黄酮的提取 称取2.5 g干燥后的南苜蓿叶粉末置于50 mL烧杯中，先加复合酶液25 mL，放入一定温度的水浴锅中酶解一定时间，之后转移至80 ℃水浴锅中灭酶10 min，取出后用乙醇加至50 mL，再放入40 ℃水浴锅中提取10 min，取出后用真空抽滤机抽滤，滤液即为含有南苜蓿总黄酮的提取液。

1.5.4 南苜蓿叶总黄酮含量的测定 吸取0.5 mL南苜蓿叶总黄酮提取液置于25 mL比色管中，按“1.5.2”节下方法测吸光度。根据芸香苷标准曲线回归方程，计算南苜蓿叶总黄酮的含量，然后计算得率。

总黄酮得率=C×25×50×100V×m×1 000×100%。

式中：C表示待测液总黄酮含量，mg/mL;V表示吸取的提取液的体积，mL;m表示提取用的样品质量，g。

1.5.5 单因素试验 选取复合酶添加量、酶解温度、酶解时间等3个因素，考察各因素对南苜蓿叶总黄酮得率的影响。在进行单因素试验时，固定复合酶添加量为1%、酶解温度为40 ℃、酶解时间为 10 min，分别改变所对应的设定因素，复合酶添加量为1%、2%、3%、4%、5%;酶解温度为30、35、40、45、50 ℃;酶解时间为5、10、15、20、25 min。

1.5.6 响应面试验 根据前期的单因素试验结果进行试验设计，然后进行响应面分析，确定最佳提取工艺。试验因素水平及相关情况见表1。

1.5.7 抑菌活性测定 采用梯度稀释分析的方法确定南苜蓿叶总黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC）[11]。

在无菌操作条件下，将各浓度梯度的南苜蓿叶总黄酮提取液各吸取2 mL，分别置于不同培养皿中，加入预先准备好的LB培养基，充分混匀，凝固后在平板中分别加入0.2 mL大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌悬液，涂布均匀，以无菌水和5%苯甲酸钠为阴性和阳性对照，将平板置于37 ℃培养箱中培养24 h，每个浓度做平行试验3次。以不长菌的最低浓度作为南苜蓿叶总黄酮的MIC。

1.5.8 抗氧化活性的测定

1.5.8.1 对DPPH·自由基清除能力的测定 将提取得到的南苜蓿叶总黄酮溶液配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同含量的样品溶液，参照Cai等的方法[10]进行DPPH·自由基清除能力测定。

1.5.8.2 对羟基自由基清除能力的测定 将提取得到的南苜蓿叶总黄酮溶液配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同含量的样品溶液，参照许建本等的方法[11]进行羟基自由基清除能力的测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 复合酶添加量的影响 在本试验中，复合酶质量之比为1 g ∶ 1 g，由图1可知，当增加复合酶使用量时，南苜蓿叶总黄酮得率逐渐上升;当在复合酶添加量为3%时，南苜蓿叶总黄酮得率最高，为1.49%;但随着复合酶添加量增加，得率没有持续升高反而出现了下降，这可能是因为酶添加量过多，此时底物完全被酶包围，植物细胞壁中的纤维素和果胶在酶的作用下产生的水解产物对黄酮类物质的吸附性较强[12]，所以复合酶添加量过多反而会使南苜蓿叶总黄酮得率降低。

2.1.2 复合酶酶解温度的影响 由图2可知，当温度小于40 ℃时，随着温度的升高，南苜蓿叶总黄酮得率增大，是因为温度升高，分子运动速度加快，使得细胞内成分更容易溶出[13];当温度大于40 ℃时，随温度升高，南苜蓿叶总黄酮得率减小，这是因为酶本质上是蛋白质， 酶蛋白会因为温度升高而变性失活，因而浸提效果变差[14]。

2.1.3 复合酶酶解时间的影响 由图3可知，总黄酮得率在酶解时间为15 min时最佳，达到1.45%，在酶解时间为 5～15 min内，南苜蓿叶总黄酮得率随着酶解时间的延长而变高;之后随着酶解时间进一步延长，得率有下降趋势。

2.2 响应面分析法优化南苜蓿叶总黄酮提取工艺

2.2.1 回归模型的建立及方差分析 通过对各试验点的响应值进行回归分析，得到总黄酮得率（y）回归模型方程为：y=1.99+0.003 75A+0.045B-0.061C-0.078AB+0.001AC-0.013BC-0.2A2-0.17B2-0.31C2。南苜蓿叶总黄酮提取工艺的响应面分析结果和回归方程方差结果分析见表2、表3。

由表3可知，该模型P值=0.000 2<0.01，属于差异极显著模型;而失拟项的P值为0.802 3>0.05，差异不显著，说明该模型能够预测试验结果的分析;模型的确定系数R2值为0.967 8，R2adj为 0.926 4，说明该试验所建立的模型拟合良好。

由3个影响因素的F值大小可以得出，各因素对南苜蓿叶总黄酮得率的影响大小分别为酶解温度>酶解时间>复合酶添加量。模型中因素一次项酶解温度（C）对南苜蓿叶总黄酮得率有显著影响，二次项A2、B2、C2对南苜蓿叶总黄酮得率有极显著影响，交互项中的复合酶添加量（A）与酶解时间（B）对南苜蓿叶总黄酮得率影响显著，其余项均不显著。说明各因素对南苜蓿叶黄酮得率的影响并不是简单的线性关系，而是存在一定的交互作用。

2.2.2 交互作用分析 根据响应面回归方程与方差分析、试验模型，建立响应面试验3D结构模型图和等高线图，结果见图4至图6。

由图4至图6可知，两两因素的交互作用对南苜蓿叶总黄酮得率影响作用的3D模型开口均是向下的，即当2个因素水平均提高时，南苜蓿叶总黄酮得率都升高;当达到一个最高值即峰值时，南苜蓿叶总黄酮得率达到最大;当2个因素水平继续升高，南苜蓿叶总黄酮得率则开始下降。通过Design Expert 8.0.6软件的计算可得最佳提取工艺方案为：复合酶用量为3.0%，酶解时间为15.7 min，酶解温度为 39.0 ℃，此时的得率为1.99%。

2.2.3 最佳提取方案驗证试验 为验证响应面试验模型的准确性与可靠性，根据上述响应面试验得到的酶辅助乙醇提取南苜蓿叶总黄酮的最佳提取方案，设定考察因素水平为：复合酶添加量3.0%，酶解时间15.7 min，酶解温度39.0 ℃，对南苜蓿叶进行酶解辅助乙醇提取总黄酮化合物，得到南苜蓿叶总黄酮得率为（1.9±0.3）%，与响应面试验结果相符，说明此响应面模型得到的南苜蓿叶总黄酮提取工艺在实践中同样可行。

2.3 抑菌活性的分析

由表4可知，南苜蓿总黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制效果，按照最低抑菌浓度测试方法标准进行分析，南苜蓿叶总黄酮对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.15 mg/mL，南苜蓿叶黄酮对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.2 mg/mL。

2.4 南苜蓿叶总黄酮抗氧化活性的测定

2.4.1 对DPPH·自由基清除能力的测定 由图7可以看出，在0.2～1.0 mg/mL的质量浓度范围内，南苜蓿叶总黄酮的浓度与DPPH·的清除率成正比，即越高清除率越强。根据Excel 2010软件分析，南苜蓿叶总黄酮对DPPH自由基的半数清除率IC50为0.368 mg/mL，维生素C对DPPH自由基的半数清除率IC50为0.108 mg/mL。

2.4.2 对羟自由基清除能力的测定 由图8可知，质量浓度范围在0.2～1.0 mg/mL时，南苜蓿叶总黄酮清除羟基自由基的能力随着浓度的增加而增加，但最大值不超过60%;而维生素C对于羟基自由基的清除能力基本维持在70～90%之间。根据Excel 2010软件分析，南苜蓿叶总黄酮对羟自由基的IC50为0.947 mg/mL，维生素C对羟自由基的IC50为0.049 mg/mL。抗氧化试验结果表明，南苜蓿叶总黄酮对羟基自由基和DPPH·均表现出一定的清除能力，但效果不如维生素C。

3 结论与讨论

以常熟本地产的南苜蓿叶为原料，首次采用复合酶酶解协同乙醇法提取其中的总黄酮，在单因素试验的基础之上，采用响应面分析法对总黄酮提取工艺进行优化，并对南苜蓿叶总黄酮的抗氧化活性及抑菌作用进行初步探索，为系统、合理、全面地开发南苜蓿资源建立科学依据。试验结果表明，南苜蓿叶总黄酮的最佳提取工艺方案：复合酶添加量为3.0%，酶解时间为15.7 min，酶解温度为39.0 ℃，在此工艺条件下，南苜蓿叶黄酮得率达到（1.9±0.3）%。抑菌试验结果发现，南苜蓿叶总黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等2种菌均有明显的抑制作用，对大肠杆菌的MIC为0.15 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为 0.2 mg/mL。体外抗氧化试验结果表明，南苜蓿叶总黄酮对羟基自由基和DPPH均表现出一定的清除能力，但效果不如维生素C。

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