酶解法制备壳寡糖的工艺探索

蒋 瑶 黄兰兰 邬思辉

（广东省食品药品职业技术学校，广东 广州 510663）

壳寡糖（COS）来源广泛、安全无毒、水溶性好，具有降低血脂、抗氧化、抑菌、抗癌肿瘤、提高免疫力等多种生物活性［1-2］。由甲壳素脱乙酰基制得的壳聚糖分子量大，其应用受到很大限制，而酶法降解壳聚糖反应条件温和且易控制、安全性高、环境污染少［3-5］。因此，在前人研究基础之上，本研究采用纤维素酶代替成本昂贵的专一性酶降解壳聚糖，通过正交实验，得最佳降解工艺条件，为壳寡糖的制备提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

壳聚糖（批号：181211A，脱乙酰度＞95%），某生物科技有限公司；纤维素酶DE-52（产品编号：C8350-100，From Whatman 4057-200），北京索莱宝科技有限公司；D-氨基葡萄糖盐酸盐（批号：HL180930Y），山东莱州市海力生物制品有限公司；再生纤维素透析膜（货号：QABO-SP132592-1m截留分子量1 000），上海安谱实验科技股份有限公司；冰乙酸，无水乙酸钠，氢氧化钠，无水乙醇，3，5-二硝基水杨酸，焦亚硫酸钠，酒石酸钾钠，苯酚。

1.2 仪器设备

电子天平，电热恒温鼓风干燥箱，紫外分光光度计，pH计，旋转粘度计。

1.3 实验方法

溶液的配制。0.2 mol/L醋酸配制：吸取11.3 mL冰醋酸溶液于1L容量瓶中，加蒸馏水定容，配制成0.2 mol/L的醋酸溶液。0.2 mol/L的醋酸钠的配制：准确称量16.2 g无水醋酸钠溶于蒸馏水中，移液至1L的容量瓶中定容，配成0.2 mol/L的醋酸钠溶液。pH 5.2醋酸-醋酸钠缓冲溶液配制：吸取0.2 mol/L的醋酸溶液和0.2 mol/L的醋酸钠溶液混合配制缓冲溶液，用pH计测量pH在5.2。壳聚糖溶液的配制：准确称取1.0 g壳聚糖原料溶于100 mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成pH 5.2的1.0%的壳聚糖溶液。酶液的配制：准确称取0.4 g纤维素酶溶于100 mL的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，配制成pH 5.2的4 g/L的酶液。DNS试剂的配制：准确称取7.5 g 3，5-二硝基水杨酸（DNS试剂）和14.0 g氢氧化钠充分溶解于1 000 mL水中，加入216.0 g酒石酸钾钠、5.6 mL预先在50℃水中溶化的苯酚和6.0 g焦亚硫酸钠，充分溶解后，盛于棕色瓶中，放置5 d稳定后，即可使用。此试剂有效期为1 m。氨基葡萄糖标准液的配制：准确称取0.1 g氨基葡萄糖盐酸盐溶于100 mL蒸馏水中，配制成1 mg/mL的氨基葡萄糖盐酸盐溶液。氢氧化钠溶液的配制：准确称取0.5 g氢氧化固体溶于蒸馏水，移液至100 mL容量瓶，定容，配制成0.5%的氢氧化钠溶液。

2 实验结果与分析

2.1 氨基葡萄糖盐酸盐的标准曲线

以质量为0.4、0.8、1.0、1.6、2.0、2.4 mg的氨基葡萄糖盐酸盐与DNS试剂反应，制作氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线，见图1。

图1 氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线

由图1可知，氨基葡萄糖盐酸盐质量在0.4～2.4 mg范围内与DNS试剂反应，反应液吸光度值与氨基葡萄糖盐酸盐质量之间呈良好的线性关系，还原糖含量越高，吸光度值越高。回归方程y=0.5069x-0.0176，相关系数R2=0.9985。

2.2 酶解条件的优化

2.2.1 底物浓度对反应的影响 壳聚糖不溶于水，溶于稀酸溶液。因此，原料壳聚糖的浓度可直接影响酶解的程度。壳聚糖醋酸-醋酸钠溶液在纤维素酶催化条件下进行降解，反应溶液pH 5.2，反应4.5 h，反应温度在50℃时，只改变底物浓度进行反应，测定溶液还原糖含量，见图2。

图2 底物浓度的影响

由图2可知，还原糖含量随着浓度升高而升高。在1%时,还原糖含量最高。超过这一浓度时，还原糖含量随之下降。说明壳聚糖浓度在1%时反应效果最佳。

2.2.2 温度对反应的影响 酶对温度具有高度的敏感性。反应温度低于最适温度时，温度升高使得酶活性增强，酶解反应加速；当温度超过最适温度后，酶活性迅速下降直至酶蛋白失去活性。壳聚糖醋酸-醋酸钠溶液在纤维素酶催化条件下进行降解，在反应溶液pH为5.2时，反应4.5 h，底物浓度在1%时，只改变反应温度进行反应，测定溶液中还原糖含量，见图3。

图3 温度的影响

由图3可知，还原糖含量随着温度升高而升高，在55℃时，还原糖含量最高，超过这一温度时，还原糖含量随之下降，说明在55℃时酶活性最高，是反应的最佳温度。

2.2.3 反应时间对反应的影响 壳聚糖醋酸-醋酸钠溶液在纤维素酶催化条件下进行降解，在反应溶液pH为相同的5.2时，于50℃下恒温反应2.5～6.5 h，测量还原糖含量。

由图4可以看出，随着反应时间的延长，还原糖含量不断增大。反应前4.5 h，还原糖含量增长迅速；4.5 h以后，反应逐渐降低。随着酶解反应的进行，壳聚糖底物量逐渐减少，导致酶解速度减慢，而且，反应时间过长容易对酶解反应产生抑制作用，因此选择反应时间为4.5 h较为合适。

2.2.4 酶量对反应的影响 保持壳聚糖含量不变，改变加入的酶量，在50℃，pH为5.2下，壳聚糖与纤维素酶反应4.5 h，测定溶液中还原糖含量。

图4 反应时间的影响

结果见图5。随着酶的增加，反应速度也加快，当酶加入量增加到12.8 mg时，继续加酶，反应速度并不增大。在酶质量很低时，只有一部分底物能与酶结合，溶液中还有多余的底物没有与酶结合。因此随着酶质量的增加，也就有更多的酶与底物结合，产物生成的速度也加快，整个酶反应速度增加，故增加酶质量可以增加反应速度。当酶质量比较多时，溶液中的酶全部与底物结合，溶液中没有多余底物，虽然增加酶质量也不会增加反应速度，此时，反应达到最大反应速度。所以酶质量为12.8 mg时，即酶底质量比要达到0.24，才能达到最大反应速度。

图5 酶质量的影响

2.2.5 正交实验 在pH值为5.2的条件下，研究温度，反应时间，酶质量对酶解反应的影响。根据极差R极的大小可以判断各因素对实验结果的影响大小，极差越大，所对应的因素对实验结果的影响越大（表1）。

正交试验中得出的最优条件为，酶底质量比为0.192，反应温度为55℃，反应时间为4.5 h。3.3壳寡糖的产率。按照冷冻干燥机的操作步骤，将透析分离好的渗透液进行冷冻干燥。得到的干燥产品及其产率如表2所示。

表1 正交试验

表2 壳寡糖产量

物料预冻后，进行升华干燥。整个冷冻过程用时平均48 h，得到壳寡糖产品平均称重为76.30 mg，即得产率为30.52%。

2.3 壳寡糖产品的定性鉴别

采用数字式旋转粘度计测出酶解液的粘度，分别测产品，1 000 Da分子量壳寡糖及原料壳聚糖的表观粘度。

由表3可知，而截留分子量为1 000 Da的纤维素膜透析得到的酶解液的产品粘度平均粘度为1.11/mPa.s，其远远小于原料物壳聚糖粘度，说明壳聚糖可以酶解成低分子量壳聚糖；而1 000 Da分子量的壳寡糖平均粘度为1.13/mPa.s。由此可知，酶解有壳寡糖生成，分子量在1 000 Da左右。

表3 各物料的粘度

3 结论

纤维素酶降解壳聚糖反应的最适条件为：在pH为5.2时，温度55℃，反应时间4.5 h，酶质量为11.2 mg；采用冷冻干燥法进行干燥后，用粘度计对产品定性鉴别，得到的分子量为1 000 Da左右的壳寡糖，算出壳寡糖的产率达30%以上。纤维素酶冷冻干燥法制备壳寡糖方法比较简单，壳寡糖产品性状较好，产率也较高。