乳腺癌患者血浆EDA片段拷贝数变化的临床意义

李涌涛 刘雨雄 张晨光 蒋威华 许文婷 欧江华

复发和转移是导致乳腺癌患者预后较差的主要原因[1～4]。现有研究显示，纤维连接蛋白(fibronectin, FN)是细胞外基质的重要组成成分，通过上皮-间质迁移，在改变细胞与周围基质的黏附能力中扮演重要角色。其中纤维连接蛋白EDA片段与肿瘤的生长和转移密切相关[5]。外周血标本留取相对无创且可多次留取，在临床工作中优势明显[6]。笔者对乳腺癌患者外周血浆的EDA片段基因的拷贝数进行检测，结合患者的预后进行了研究，现报道如下。

资料与方法

1.研究对象:选取笔者医院2014年1～12月行手术的乳腺癌患者，同时选择同时期行手术的良性乳腺病患者。所有入选患者均留取了外周血标本，且均签署标本留取知情同意书。最后研究组入选98例患者，对照组选择100例病理为乳腺腺病的患者。患者均为女性，乳腺癌组患者中位年龄46岁(28～67岁)，其中，汉族70例，维吾尔族25例，哈萨克族3例；无淋巴结转移13例，有淋巴结转移85例。

2.纳入标准：研究组均有明确的浸润性乳腺癌病理诊断，手术时无远处转移，未进行术前化疗，非妊娠、哺乳期患者，且临床病理及随访资料完整；对照组病理结果为良性病变，且留取外周血标本。排除标准：炎性乳腺癌，乳腺癌患者在治疗中出现远处转移，在治疗后及随访中乳腺癌患者外周血标本留取不全。

3.乳腺癌患者随访情况：所有乳腺癌患者术后均行辅助化疗，依据治疗指南继续行后续放疗、内分泌等综合治疗。所有乳腺癌患者在化疗结束时均未发现复发或远处转移。随访患者5年，其中28例患者出现复发或转移。3例患者胸壁或区域淋巴结局部复发，6例单纯骨转移，5例肝转移，7例肺转移，1例脑转移，1例区域淋巴结复发及骨转移，5例多脏器转移。

4.标本留取：所有患者均在手术前抽取外周血，加入抗凝管中，经离心后分离上层血浆，置于-80℃冰箱保存。乳腺癌患者在化疗结束后再次抽取外周血离心后留取标本。随访过程中发现复发或转移时再次抽取外周血离心后留取标本。未发现复发或转移患者在随访5年时抽取外周血离心后留取标本。

5.研究方法：对标本进行DNA提取，采用美国Omega基因组DNA提取试剂盒。采用AccuCopyTM多重基因拷贝数检测试剂盒进行PCR扩增：取2μl DNA模板与2μl内对照DNA混合液混匀后，加入10μl 2× PCR Master Mix, 1μl多重PCR引物混合液以及5μl ddH2O。PCR循环程序：95℃ 10min; 11cycles×(94℃ 20s,65℃ 40s,72℃ 1min 30s);24cycles×(94℃ 20s, 59℃ 30s, 72℃ 1.5min); 60℃ 60min; 4℃ for ever。取1μl PCR产物稀释20倍后，取1μl与0.5μl Liz500 SIZE STANDARD，8.5μl Hi-Di 混匀，95℃变性5min后上ABI3130XL测序仪。根据每个基因的样本DNA/内对照DNA扩增产物长度及荧光标记信息，利用GeneMapper4.0对ABI3130XL测序仪生成的数据文件进行分析，输出每个产物峰的峰高以及峰面积。输出结果采用EXCEL进行整理、统计和分析。

6.拷贝数确定：取一定量的DNA片段混合物，然后与适量的样本DNA混合，进行PCR扩增，产物经毛细管电泳后，对(样本DNA与竞争DNA)扩增产物根据其长度差异进行分离，分析每个基因片段的S/I(峰面积比)值，利用参照基因S/I值对目标基因S/I值进行校正后获取目标基因的准确拷贝数(图1)。拷贝数取整数，笔者将拷贝数>2确定为多拷贝。

图1 采用AccuCopyTM多重基因拷贝数检测的不同拷贝数结果判读图

7.统计学方法：采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料采用例数(百分比)[n(%)]表示，不同组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.乳腺癌与良性患者外周血EDA片段拷贝数检测结果：98例初诊乳腺癌患者的血浆标本纤维连接蛋白EDA片段拷贝数检测，结果39.8%(39/98)的患者检测到EDA片段多拷贝。而在同期留取的100例病理为乳腺腺病患者血浆标本中，仅有2.0%(2/100)检测到EDA片段多拷贝，两组患者比较，外周血浆中纤维连接蛋白EDA片段多拷贝乳腺癌患者明显高于良性乳腺疾病患者，差异有统计学意义(χ2=43.062，P=0.000,表1)。

表1 乳腺腺病与乳腺癌患者血浆EDA片段拷贝数结果比较[n(%)]

2.乳腺癌患者治疗前后血浆纤维连接蛋白EDA片段拷贝数检测：乳腺癌患者手术前及手术+化疗治疗后留取外周血浆标本，治疗前39.8%(39/98)的患者检测到EDA片段多拷贝，治疗后18.4%(18/98)的患者检测到EDA片段多拷贝，两组比较，乳腺癌患者外周血浆中纤维连接蛋白EDA片段多拷贝在治疗前后有明显变化，差异有统计学意义(χ2=10.91，P=0.001,表2)。

表2 治疗前后乳腺癌患者EDA片段多拷贝结果比较[n(%)]

3.不同血浆纤维连接蛋白EDA片段拷贝数的乳腺癌患者结局情况：98例患者中28例出现复发或转移。治疗前39例患者检测到血浆EDA片段多拷贝，41.0%(16/39)的患者出现复发或转移；59例未检测到血浆EDA片段多拷贝的患者中仅有20.3%(12/59)的患者出现复发或转移，两组比较，治疗前乳腺癌患者外周血检测到EDA片段多拷贝，其出现复发转移的风险明显升高，差异有统计学意义(χ2=4.923，P=0.026,表3)。

表3 患者血浆EDA片段多拷贝与乳腺癌复发转移结局比较[n(%)]

4.血浆纤维连接蛋白EDA片段拷贝数变化在不同乳腺癌患者结局中的比较：随访患者5年，14例患者从EDA片段多拷贝未检测到变为检测到，57.1%(8/14)的患者结局为复发或转移；而在EDA片段多拷贝一直未检测到45例患者，仅8.9%(4/45)出现复发或转移，两组比较差异有统计学意义(χ2=15.345，P=0.000,表4)。9例患者从EDA片段多拷贝变为未检测到，随访5年未发现复发或转移，EDA片段呈持续多拷贝状态的30例患者，53.3%(16/30)结局为复发或转移，两组比较差异有统计学意义(χ2=8.139，P=0.004,表4)。

表4 乳腺癌患者血浆EDA片段拷贝数变化在不同结局中的比较[n(%)]

讨 论

乳腺癌发生率呈逐年升高趋势，已成为女性发生率首位的恶性肿瘤[7]。复发转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因[8]。其中纤维连接蛋白EDA片段在肿瘤细胞的黏附、迁移、增殖以及肿瘤生长中扮演了重要角色。EDA片段通过加强纤维连接蛋白与整合素的结合而促进肿瘤细胞的黏附和转移，通过增加平滑肌肌动蛋白的合成而增强肿瘤细胞自身的运动能力，还可通过Ras-MAPK/ERK途径增强细胞的DNA合成，促进细胞周期进展，导致细胞分裂增殖[9～11]。还有相关研究显示EDA片段可促进肿瘤淋巴管及血管的形成，从而促进肿瘤的转移[12，13]。这些都提示纤维连接蛋白EDA片段可以作为一个更好的检测指标来辅助诊断和预测乳腺癌转移。通过对EDA片段拷贝数检测，能较好地反映该基因片段功能，更好地反映其在肿瘤生长转移中的作用，因此笔者对不同预后的乳腺癌患者EDA片段拷贝数进行检测，有一定的临床意义。

EDA 片段序列高度保守，位于人类2号染色体外显子5431～5701bp处。EDA片段在正常人血浆中含量很低或无法检测到, 而在癌症患者的血液样本中EDA +FN含量可显著升高[14，15]。相关研究显示，结肠癌患者肿瘤组织与血清中的EDA水平明显增加[16]。因此笔者检测乳腺癌患者血浆中纤维连接蛋白EDA片段的拷贝数变化，结果在39%的乳腺癌患者血浆标本中检测到EDA片段多拷贝，显著高于仅有2%检测到EDA片段多拷贝的同期良性乳腺疾病患者，这也与现有的相关研究结果相一致。显示了血浆EDA片段拷贝数可以作为乳腺癌的一个更好辅助诊断检测指标。

外周血浆液体标本相对于组织标本，检测的损伤小，稳定性好，便于留取，同时可以多次留取进行动态观察[17]。因此本研究选择患者血浆标本进行研究。有关血浆中EDA片段拷贝数检测的研究鲜见，通过研究发现，在治疗前39.8%的患者中检测到EDA片段多拷贝，治疗后变为18.4%，也就是乳腺癌患者外周血浆中纤维连接蛋白EDA片段多拷贝在治疗前后有明显降低，两组比较差异有统计学意义(P=0.001)。同时随访中，有9例患者从EDA片段多拷贝变为未检测到，随访5年未发现复发或转移，而EDA片段呈持续多拷贝状态患者，有53.3%(16/30)结局为复发或转移，两组比较差异有统计学意义(P=0.004)。这也显示了血浆EDA片段拷贝数可以作为一个乳腺癌治疗效果参考的检测指标。

相关研究发现,EDA片段在肿瘤转移中扮演重要角色，在乳腺癌的发生、发展中，EDA片段可通过EMT促进肿瘤细胞的黏附和迁移[18]。笔者通过研究发现，在治疗前检测到血浆EDA片段多拷贝，41%的患者结局为复发或转移。而在EDA片段一直未检测到的患者中，仅20.3%出现复发或转移。肿瘤生长必需有血管为之提供氧及营养物质。研究发现，EDA片段在肿瘤血管形成过程中有一定作用[19]。那么动态观察血浆EDA片段拷贝数，发现乳腺癌及随后的过程中EDA片段呈持续多拷贝状态的患者，53.3%的患者结局为复发或转移。从EDA片段多拷贝未检测到变为检测到，57.1%的患者出现复发或转移。结合相关研究，动态监测血浆EDA片段拷贝数，可以作为乳腺癌复发或转移的辅助预测指标，同时对复发风险高的患者的后续加强治疗提供参考价值[20]。

综上所述，通过对乳腺癌患者纤维连接蛋白EDA片段拷贝数检测，笔者发现外周血浆液体标本留取方便，可多次留取进行动态观察。外周血浆EDA片段多拷贝在乳腺癌患者中显著高于良性乳腺疾病患者，提示EDA拷贝数检测可以作为诊断乳腺癌的一个辅助诊断检测指标。动态监测发现，呈持续EDA多拷贝及从未检测到变为后期随访又检测到EDA多拷贝的患者，50%的结局为复发或转移，显示了血浆EDA片段拷贝数检测可以作为预测患者预后的辅助检测指标，可以在今后的临床工作中提供一种无创的手段来进行乳腺癌的诊断与预后的评估。