Notch信号通路在骨髓间充质干细胞及骨代谢疾病中的功能研究进展

雷乐 张玲莉 杨杰*

1. 上海体育学院，上海 200438 2. 华南师范大学，广东 广州 510631

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种具有多向分化能力的成体干细胞，位于骨髓腔内。在一定的微环境或培养条件下，BMSCs可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞、神经细胞和血管内皮细胞等[1-2]。而成骨细胞、骨细胞和破骨细胞的数量和协调活动决定了骨骼重塑和骨量的变化，因此BMSCs对骨骼发育和骨转换起着至关重要的作用。近年来，研究发现Notch信号通路与BMSCs的增殖、分化与凋亡有密切相关。

Notch信号通路在细胞的整个生命活动中扮演着重要的角色，是一条保守而重要的信号转导通路，在神经、心血管和骨骼等系统中都有重要的意义。Notch信号通路对骨骼细胞活动和骨骼发育尤为关键[3]，调节细胞分化、增殖和凋亡，其功能异常可导致各种累及颅面与骨骼的先天性疾病[4]。且受多种因素的影响，譬如外源性药物或因子调节Notch信号通路的关键基因和蛋白表达，机械载荷能够激活Notch信号通路的靶基因，从而调节BMSCs的增殖与分化。

本文通过查阅国内外文献，旨在阐述外源性药物和因子和机械载荷介导Notch信号通路对BMSCs的影响，并总结了Notch信号通路在骨代谢疾病中的研究近况。

1 Notch信号通路与BMSCs的关系概述

Notch最早是在果蝇的研究中发现的一种基因，因该基因可以导致果蝇翅膀边缘缺损，故被称为Notch[5-6]。Notch信号通路由几种高度保守的成员组成，主要包括受体、配体、CSL蛋白及Notch信号的效应分子[7]。在哺乳动物中Notch家族主要有4种受体(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)、5种配体(DLL1、DLL3、DLL4、Jag1、Jag2)，均属于单次跨膜蛋白。CSL蛋白是一种DNA结合蛋白，其名称来源于哺乳动物(CBF1，也称RBP-Jκ)、果蝇[Su(H)]与线虫(Lag-1)的三个首字母，因为CSL蛋白主要存在于这三种物种之中。Notch信号效应分子主要为HES，是进化保守的基本螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子，HES家族中有6个成员，其中HES1、HES5、HES7在Notch信号通路中发挥重要作用，是Notch信号通路的下游靶基因[8]。Notch信号通路的激活主要经过三次酶切反应和蛋白水解：Notch受体合成后首先在高尔基体内被切割，为第一次酶切(S1)；之后在胞外被肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)转化酶酶切为第二次酶切(S2)；酶切产生的不稳定过渡多肽被γ-分泌酶复合体识别并进一步将Notch受体的胞内段酶切，为第三次酶切(S3)，三次酶切后Notch信号通路被激活，释放出具有活性的Notch胞内结构域(Notch intracellular domain，NICD)进入细胞质，在胞质内移动进入细胞核，与核内的转录抑制因子CSL/CBF-1蛋白结合，将转录抑制因子转换为转录活化因子，作用于Notch信号通路的靶基因HES(hairy/enhancer of split)、HEY(hairy/enhancer of split with YRPW motif family members)，进而调节细胞的增殖、分化。

Notch信号通路在骨代谢中有重要作用，当其出现异常时会导致骨发育失调、骨质疏松、骨软化等疾病。其上下游基因遗传突变也会导致一系列骨疾病[9]。Notch信号通路对成骨细胞、破骨细胞的功能调节均有重要影响。DSL配体诱导Notch受体的切割和NICD的产生。成骨细胞前体中Notch1的活化可通过抑制osterix(Osx)、runt相关转录因子2(Runx2)和胞质β-连环蛋白抑制成骨细胞生成，影响骨形成；破骨细胞前体中的Notch2 NICD与NF-κB相关，诱导活化T细胞(Nfatc)1转录和破骨细胞增加，骨形成受损和骨吸收增加导致骨量减少(如图1左侧所示)。成骨细胞中Notch1的激活可诱导Rankl抑制剂骨保护素(OPG)，从而抑制松质骨吸收。骨细胞中Notch1激活抑制硬化蛋白(Sclerostin)和Dkk1，增强Wnt信号，增加皮质骨形成。松质骨吸收减少和皮质骨形成增强导致骨量增加[10](如图1右侧所示)。Zanotti等[10]认为，Notch通过抑制Wnt信号传导并与Runx2相互作用来抑制成骨细胞成熟，而在成熟的成骨细胞中Notch抑制其分化功能，Notch1可抑制破骨细胞生成，而Notch2则通过与NfκB相互作用来诱导Nfatc1与破骨细胞分化。同时，Deregowski等[11]研究发现，Notch1活化抑制成骨细胞分化，Notch能够抑制Wnt/β-catenin信号传导，但不抑制骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)信号转导。此外，Notch信号通路下游的HES和HEY蛋白能够抑制Runx2的功能，从而抑制成骨细胞的生成[12]。Ji等[5]研究发现，Notch信号通路在BMSCs分化为成骨细胞时未被激活，在成骨细胞分化为骨细胞时被激活，而BMSCs成骨分化早期会抑制Notch信号传导促进BMSCs向成骨细胞分化，积累成熟的成骨细胞，而到成骨细胞分化晚期，Notch信号传导抑制成骨细胞向骨细胞的分化与矿化。Notch抑制MSC向成骨细胞的分化并促进成骨细胞向骨细胞的分化(如图2所示)。也有研究[13]表明Notch通路对BMSCs的调节并不是单一的促进或抑制，而是在全身或局部相关因子调节下的结果。Notch信号通路对成骨细胞的作用更多是建立在与其他信号通路的相互作用，这些相互作用调节成骨细胞的机制尚未明确，有待进一步研究。

2 不同干预手段介导Notch信号通路对BMSCs的影响

2.1 外源性药物或因子介导Notch信号通路对BMSCs的影响

图1 Notch信号传导和骨重建调节[13]Fig.1 Notch signaling pathway and bone remodeling regulation

图2 成骨细胞分化中Notch信号传导模型Fig.2 Notch signaling model in the osteoblast differentiation

在国内，药物干预对Notch信号通路的影响以中成药居多。张颖等[14]研究发现，复方扶芳藤合剂含药血清能上调大鼠BMSCs中Notch信号通路关键基因和蛋白的表达，激活Notch信号通路。韩亚力等[15]使用成分为骨碎补总黄酮(davallia mariesil flavones，DMF)的强骨胶囊进行动物实验，发现DMF能下调大鼠Notch1与Hes1蛋白表达量，改善大鼠骨质疏松，提示其作用机制可能与Notch信号通路被抑制有关。周灵通[16]实验发现固本增骨方含药血清能上调Notch1 mRNA、下调CBF1 mRNA的表达，促进BMSCs增殖与成骨分化。张志明等[17]发现葛根素能使细胞DLL4含量增加，促进BMSCs骨向分化。邓宇等[18]研究发现，淫羊藿苷能够通过上调HES1、Runx2 mRNA的表达以及增加Notch1、CBF1、Jag1来促进BMSCs的骨向分化。Liu等[19]研究也发现淫羊藿苷可以抑制MSCs向成脂细胞分化，下调骨组织中Notch1细胞内结构域(N1ICD)Jag1蛋白的表达，并抑制N1ICD对Notch2 mRNA表达，改善去卵巢大鼠骨质疏松。邢贞武[20]发现提取骨质疏松患者的BMSCs进行离体培养，添加补骨脂素后，受体Notch1、配体Jag1和Hes1的表达增高，说明补骨脂素能提高BMSCs的Notch信号通路的关键分子表达，提示补骨脂素能通过Notch信号通路促进成骨分化，抑制成脂分化。

目前，对作用于Notch信号通路的西药研究较少，介导Notch信号通路调节BMSCs分化功能的西药研究尚未报道，而中药调节Notch信号通路仅仅是对通路上重要靶基因和关键蛋白进行研究，其具体机制尚不明确，还有待于进一步研究。

2.2 外源性因子介导Notch信号通路对BMSCs的影响

外源性因子可以介导Notch信号通路诱导BMSCs分化为成骨细胞、软骨细胞等，对骨代谢维持平衡具有重要意义。Diaz-Tocados等[21]通过实验观察发现，氯化镁能够通过Notch信号传导激活BMSCs扩增，促进成骨细胞成熟。王维东等[22]研究发现甲状旁腺素(parathyroid hormone，PTH)基因敲除的小鼠其Notch信号通路上的受体Notch1和配体Jag1表达低于野生小鼠，提示内源性PTH缺失可能通过降低Notch信号通路受体和配体的表达来抑制BMSCs的骨向分化。范金柱等[23]发现绝经后骨质疏松女性与健康女性相比，BMSCs中Notch信号通路减弱，给予患者补充雌激素后，Notch信号通路恢复活性，受体Notch1、配体Jag1表达升高，通路下游分子Hes1也表达上升，提示雌激素能促进BMSCs向成骨分化，Notch信号通路可能成为治疗绝经后骨质疏松患者的新靶点。徐莹等[24]对培养的BMSCs给予糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)处理后发现Notch信号通路的靶基因Hes1表达降低，提示GCs可以通过抑制Notch信号通路表达抑制BMSCs成骨分化。郑介柏等[25]发现γ分泌酶特异性抑制剂DAPT(γ-secretase inhibitor)能够阻断Notch信号通路活化，抑制BMSCs的增殖，同时Notch信号通路活化抑制后，ALP活性增强，BMSCs骨向分化能力增强。

外源性的因子通过调节Notch信号通路的关键受体和配体，影响BMSCs的分化功能，涉及到激素、金属离子，但是研究较少，其具体机制仍有待进一步阐述。

2.3 机械刺激介导Notch信号通路对BMSCs的影响

机械刺激调节Notch信号传导并影响细胞的活动。Manokawinchoke等[26]对小鼠前成骨细胞系干预发现，间歇性压应力上调Notch信号传导的靶基因表达，诱导的Hes1、Hey1 mRNA可被DAPT抑制，这一实验提示Notch信号参与了骨细胞在机械应激刺激下的稳态维持。张鹏等[27]使用基因芯片技术检测到Notch信号通路中的Jag1在应力组明显上调，可能是Notch信号通路被早期激活，参与BMSC成骨分化过程。Tanabe等[28]研究发现Notch1蛋白在压力刺激下降低，而骨膜蛋白(Periostin)能够与Notch1前体结合，维持Notch1在压力刺激下的信号传导。刘玉林等[29]研究发现，BMSCs在低声压次声的干预下Jag1、Notch1、Hes1 基因及蛋白表达显著增加，激活Notch信号通路。Ziouti等[30]研究发现，循环拉伸BMSCs后通过生物反应器系统检测到Notch靶基因的表达上调，进一步研究证明Notch信号控制BMSCs中机械反应基因的表达，其中Notch2是介导Notch信号对BMSCs作用的关键受体。在机械刺激下，BMSCs向成骨分化的生物特性会发生相应改变，Notch信号传导中的受体和配体也会受到影响。

3 Notch信号通路在骨代谢相关疾病中的功能作用

3.1 Notch信号通路与Alagille综合征

Alagille综合征(Alagille syndrome，ALGS)是一种多系统受损的遗传疾病， 33%～87%的患者出现骨骼异常，表现为椎骨异常(蝴蝶椎骨)或矢状裂，受影响的椎骨椎体分裂，形成成对的半椎骨，在影像学中表现为“蝴蝶”特征的外观[31]。同时患者还可能出现身材矮小、骨质疏松等表现[32]。Notch信号通路中的Jag1和Notch2基因突变可能是造成Alagille综合征的原因之一。在94%～96%的病例中可检测到Jag1基因出现变异，1%～2%的病例中检测到Notch2基因突变[33-34]。

3.2 Notch信号通路与Adams Oliver综合征

Adams Oliver综合征(Adams Oliver syndrome，AOS)是一种罕见的先天性疾病，其特征是先天性发育不全和末端横向肢体缺陷，该疾病与6种遗传基因突变相关(ARH-GAP31、DLL4、Notch1、RBPJ、DOCK6、EOGT)[35]，Notch1、DLL4和RBPJ基因编码的蛋白质是Notch信号转导途径的一部分。其中，Notch1和DLL4蛋白对血管发育至关重要，Notch1突变主要与肢体缺陷有关，表现为肢体指体缺失或畸形，患者手指或脚趾可能表现为融合、过短或缺失[36]。

3.3 Notch信号通路与脊椎肋骨发育不良

脊椎肋骨发育不良是一种罕见疾病，其特征是椎体分割缺陷和继发缺陷性椎体形成的肋骨异常，表现为颈部短而僵硬和躯干较短[37-38]。Notch信号通路的功能之一是在早期发育过程中调节椎骨和肋骨分开，即体节分割。当Notch信号转导途径被破坏时，体节分割不能正常发生，导致椎骨、肋骨的畸形和融合[39]。这种疾病产生可能是DLL3突变造成Notch配体截断或折叠错误的蛋白翻译[40]。

3.4 Notch信号通路与Hajdu-Cheney综合征

Hajdu-Cheney综合征(Hajdu-Cheney syndrome，HCS)是一种罕见的遗传性疾病，也称为遗传性骨发育不良并肢端溶骨症，其特征为手和脚的骨质疏松症以及骨骼、牙齿和关节的发育缺陷，导致特殊的颅面和颅骨改变，骨质疏松症和身材矮小。Notch 2的外显子区域缺失或发生无义突变，导致含脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸的结构域缺乏蛋白质产物[41]。突变导致截短的稳定Notch2蛋白的形成和Notch2在信号传导中增强。颅面和心血管发育异常的病理机制可能与Notch对骨骼和心脏发育的影响有关，身材矮小可能继发于Notch对软骨形成的抑制作用，但具体的发病机制尚未阐明。

3.5 Notch信号通路与骨折愈合

骨折愈合是一个复杂的再生过程，骨折后会产生结缔组织和新骨。当骨折机械稳定时，骨折愈合通过膜内骨形成，当骨不稳定时由软骨内骨化[42]。在骨折愈合早期的骨膜中，Notch受体Notch1-4、配体Jag2和靶基因HES1、HEY1的表达受到抑制[43]，又有研究发现经过5、10、20 d愈合的小鼠胫骨组织中，Notch受体、配体和靶基因上调，主要是由于Notch信号传导可以调节成骨细胞、软骨细胞与骨血管生成，在骨生成过程中表达更高以增强骨修复[44]。由于Notch对骨生成和软骨形成具有抑制作用，Notch信号的下调可能是骨折愈合过程发生的必要条件，使用在MSH同源框1启动子控制下表达的显性阴性MAML1来抑制Notch转录激活的研究表明，Notch信号传导是成功骨折愈合所必需的[45]。

综上所述，Notch信号通路对BMSCs的命运有重要的影响，调节成骨细胞的分化和功能。在未成熟的成骨细胞中，Notch可以抑制成骨细胞成熟及分化；在成熟的成骨细胞中，Notch抑制其分化。这也使Notch信号通路近年来成为骨重建研究中的热点。

Notch信号通路与先天性骨代谢疾病密切相关，也说明其在骨骼发育中发挥重要功能。通过梳理目前BMSCs中Notch信号通路的相关研究，发现外源性药物或性因子与机械载荷可以介导Notch信号通路调节BMSCs的多种分化功能，从而调节骨骼发育。Notch信号通路异常时会影响骨骼发育，这成为多种骨代谢疾病可能的病理机制之一。