利拉鲁肽对2型糖尿病骨质疏松大鼠miRNA-19a、miRNA-144及骨密度的影响

王志刚 刘菊

武汉市第一医院老年病科，湖北 武汉 430000

糖尿病性骨质疏松症(diabetic osteoporosis，DOP)是目前临床中常见的2型糖尿病合并症，患者多表现为骨脆性增高、骨强度减弱、单位骨量减少和骨组织细微结构变化等全身性骨质病变[1]。有研究指出，2型糖尿病的多种并发症中DOP是最为常见的多发性骨骼系统并发症，一般情况下在出现DOP后患者极易出现骨折等不良预后的发生[2]。目前临床中多采用增强骨密度和控制血糖等常规对症方案进行干预治疗，虽然其可有效改善患者主要症状，但对致病环境和体质改善的影响存在一定不足，且长时间治疗极易导致患者出现多种不良反应[3]。有研究指出，胰岛β细胞功能减退在2型糖尿病的发生和发展过程中起到十分重要的作用[4]。miRNA在胰岛β细胞功能调控过程中起到十分重要作用，可有效维持并调节体内葡萄糖动态平衡[5]。利拉鲁肽是经典的GLP-1类似物，可有效促进胰岛素的合成与分泌，加速胰岛素的生物合成[6]。但利拉鲁肽在DOP中的应用仍鲜有报道，因而笔者构建DOP大鼠模型分析利拉鲁肽对大鼠miRNA-19a、miRNA-144及骨密度的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本研究中选择使用SPF级健康4～6周龄雌性SD大鼠，体质量(162.6±7.4)g，所有大鼠均置于25～28 ℃条件下适应性饲养1周，自由饮水进食，自然采光通风，所有大鼠饲料及垫料均购买自南京青龙山动物繁育场。

1.2 分组方法造模

1.2.1DOP大鼠造模方法：将50只大鼠依照体重编号，后采用随机数表法将所有大鼠随机分为4组，分别为正常组、去势对照组、模型组及给药组，正常组及去势对照组10只，模型组及给药组各15只。正常组及去势对照组大鼠使用普通饲料饲养，模型组及给药组大鼠均给予高脂饲料饲养，4周后禁食12 h，去势对照组、模型组及给药组均进行去势，且均采用手术方法将卵巢切除，后缝合肌肉和皮肤，并使用青霉素干预抗炎，后模型组及给药组大鼠均使用2%链脲佐菌素依照35 mg/kg剂量腹腔注射干预，正常组注射等量的柠檬酸盐缓冲液，72 h后采用断尾取血法检测大鼠空腹血糖值，若血糖值≥16.7 mmol/L则判定造模成功。造模完成后持续性高脂高糖喂养7周，后采用双能X线骨密度检测仪对骨密度进行测定，若造模后大鼠骨密度低于正常组的2.5个标准差则判定DOP造模成功。

1.2.2干预方法：本组研究中在造模完成后模型组及给药组分别随机选择大鼠10只，后依照分组方法进行治疗。给药组大鼠采用利拉鲁肽进行治疗，依照每天一次每次0.1 mg/kg剂量皮下注射干预，4周后依照每天1次，每次0.2 mg/kg的剂量皮下注射，持续治疗12周。正常组、去势对照组及模型组均依照相同的给药方法给予生理盐水干预。

1.3 观察指标

本研究中在治疗结束后采集大鼠血液样本，检测大鼠空腹血糖及胰岛素水平。将大鼠使用乙醚麻醉，后使用双能X线骨密度检测仪对骨密度进行检测，检测过程中固定四肢，后保持双侧股骨水平，椎体竖直，后测定腰椎、全身、骨盆及股骨骨密度。采用Western blot法检测各组大鼠血中钙黏蛋白11(Cad-11，抗体批号：181202-1)及胰岛素受体底物1(IRS1，抗体批号：181023)水平，以Cad-11/GAPDH和IRS-1/GAPDH表示Cad-11及IRS1表达水平，所用抗体均购买自CST公司，一抗抗体稀释比为1∶1 000，二抗抗体稀释比1∶200。并采集大鼠血液样本，采用Trizol法提取总RNA后采用PT-PCR法检测血中miRNA-19a及miRNA-144水平，测定miRNA的Ct值，并计算2-△Ct值计为基因表达量，所用PCR引物均购买自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.4 统计学处理

本研究使用SPSS 20.0行统计学分析，采用百分率和均值±标准差表示计数和计量资料，后行卡方和方差检验分析组间数据差异，采用LSD-t检验表示两组间数据差异，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血糖及胰岛素水平检测结果

四组大鼠血糖及胰岛素水平差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中正常组中大鼠空腹血糖最低而胰岛素最高，给药组空腹血糖及胰岛素水平均明显优于模型组及去势对照组，详见表1。

表1 各组大鼠血糖及胰岛素水平检测结果

2.2 各组大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平检测结果

四组大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平差异均具有统计学意义(P<0.05)，其中正常组中大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平最低，且给药组大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平明显低于模型组及去势对照组，且差异具有统计学意义(P<0.05)，详见表2。

表2 各组大鼠miRNA-19a及miRNA-144水平检测结果

2.3 各组大鼠Cad-11及IRS1水平检测结果

四组大鼠Cad-11及IRS1水平差异具有统计学意义(P<0.05)，其中正常组中大鼠Cad-11及IRS1水平最高，给药组Cad-11及IRS1水平明显高于模型组及去势对照组，且差异存统计学意义，详见表3。

2.4 各组大鼠骨密度值检测结果

四组大鼠全身、胸腰椎、双侧股骨盆骨及腰椎部

位骨密度差异具有统计学意义(P<0.05)，其中正常组中各部位骨密度最高，给药组各部位骨密度明显高于去势对照组和模型组(P<0.05)，详见表4。

表3 各组大鼠Cad-11及IRS1水平检测结果

图1 WB检测图Fig.1 WB detection chart

表4 各组大鼠骨密度值检测结果Table 4 Bone mineral density of rats in each

3 讨论

OP是较为常见的以骨微结构改变、骨量降低为主要特诊的一类疾病，OP发生后极易导致骨脆性增加并导致骨折的出现，属于常见的全身性代谢疾病[7]。虽然有学者认为糖尿病和OP属于独立性疾病，糖尿病是导致OP发生与发展的独立性危险因素，患者在出现糖尿病后并发OP的概率显著升高[8]。此外，有流行病学研究结果显示，与同性别、同年龄的人群相比较，糖尿病患者OP及骨质减少发生率均显著升高，虽然其发病机制尚未完全揭示，但有研究认为其和糖尿病患者长时间胰岛素分泌量不足、高血糖、多脏器病变、神经及血管系统病变等多种因素密切相关[9]。此外，糖尿病患者的饮食控制、长期服用降糖药物、胰岛素样生长因子、雌激素、体重、瘦素、年龄及性别等因素均可能在DOP的发生及发展过程中扮演十分重要的角色。

DOP的发生及发展过程中胰岛细胞的功能及数量减退在其中起到十分重要的作用，传统的对症治疗药物无法有效调控胰岛细胞的分化、增殖等功能，且无法有效调控骨代谢失衡[10]。GLP-1类似物可有效加速修复胰岛细胞，改善骨代谢。利拉鲁肽是经典的GLP-1类似物药物，GLP-1属于有以高血糖素原前体经酶加工后而来的肠促胰岛素，是由20个氨基酸构成的由L细胞释放，可有效抑制胰高血糖素的释放并改善胰岛素的分泌量[11]。利拉鲁肽是化学合成的GLP-1类似物，在对2型糖尿病进行治疗时具有较高的临床疗效，利拉鲁肽可有效控制血糖、减轻体质量，属于治疗糖尿病的新药[12]。有学者采用动物实验进行研究发现GLP-1可有效正性调节骨代谢，间接或直接作用于骨细胞，降低骨硬化蛋白水平，激活Wnt/β-catenin信号通路[13]。而miRNAs是参与细胞修复和骨代谢调控的重要内源性物质基础，在DOP病情发生及发展过程中起到十分重要的作用。有研究指出，miRNA-19a、miRNA-144是机体内重要的胰岛素信号转导通路受体的靶基因，其参与体内胰岛素生物学功能的调控[14]。因而本研究中选择利拉鲁肽作为受试药，分析其对DOP大鼠miRNA-19a、miRNA-144及骨密度的影响。

本研究结果显示，去势对照组的血糖高、胰岛素水平降低，分析认为，去势对照组大鼠将双侧卵巢摘除后可能导致大鼠出现病理性改变，引起体内内分泌系统异常，导致大鼠出现代谢异常进而导致血糖水平升高，并影响胰岛素代谢，降低其中胰岛素水平。使用利拉鲁肽治疗后可显著改善大鼠血糖及胰岛素水平，有效调控miRNA-19a、miRNA-144的表达的同时提高Cad-11及IRS1水平。此外，对大鼠各部位的骨密度进行检测结果显示，采用利拉鲁肽治疗后显著改善大鼠全身、胸腰椎、双侧股骨盆骨及腰椎骨密。分析认为，DOP大鼠采用利拉鲁肽治疗后可显著改善其血中胰岛素及血糖水平，其与GLP-1类似物的作用原理密切相关。有学者[15]研究结果显示，miRNA-19a、miRNA-144是调节胞内Cad-11及IRS1基因表达，并通过调控转录RNA及蛋白翻译和修饰，而Cad11及IRS1在骨代谢过程中起到十分重要的作用。本研究结果提示，利拉鲁肽可通过有效调控体内miRNA-19a、miRNA-144表达水平提高Cad-11及IRS1表达进而起到逆转骨形成与骨代谢失衡，有效加速骨质生成进而提高大鼠各部位的骨密度。本研究结果提示，在临床中可采用利拉鲁肽对糖尿病骨质疏松症患者进行治疗干预，有助于提高治疗质量。

综上所述，利拉鲁肽可有效降低2型DOP大鼠miRNA-19a、miRNA-144水平，并提高大鼠骨密度。但本研究并未对利拉鲁肽对DOP大鼠基因表达谱的影响进行深入研究分析，仍有待后续深入分析研究。