前列腺癌中血管内皮生长因子及其受体和RBM5表达的相关性及临床意义

张秋爽,杨 潇,李然伟,冯树强,田文杰,杨 贺,姜 爽

(吉林大学第二医院 泌尿外科,吉林 长春130041)

血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)被认为是迄今为止已知活性最强，特异性最高的血管生长诱导因子，它主要通过其含激酶插入区受体(Kinase insert domain containing receptor,KDR)发挥作用[1,2]，以旁分泌方式促进细胞增殖进而形成新生血管。但近期研究表明KDR在人体多种恶性实体肿瘤细胞过量表达，提示在肿瘤细胞内可能存在VEGF的自分泌途径[3]。另有研究认为，VEGF表达与P53和RBM5基因突变有关，当微环境发生变化，组织细胞缺血缺氧时其抑癌作用的生物学效应才会受到影响[4,5]。本研究除初步探索前列腺癌(PCa)患者组织细胞中是否存在VEGF自分泌现象，还检测RBM5与VEGF及其受体KDR之间的相关性，以进一步探寻双位点，甚至多位点用药治疗肿瘤的有效途径，同时也为预测和评估PCa术后复发转移的风险因子提供一定的科学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2012年1月至2017年12月在我院采用腔内技术经尿道手术的196例PCa患者的组织标本。患者的中位年龄是73.6岁(58-91岁)。术前均经直肠超声引导前列腺穿刺活检诊断为PCa。术后病理Gleoson评分：2-4分组118例，5-7分组54例，8-10分组24例。病理分期：非胞膜浸润(T2以内)114例，浸润到包膜者(T3及T3以上)82例。其中腺癌191例，鳞癌5例。术后通过肛诊、PSA、腔内超声和CT临床随访3-60个月。

1.2 观察方法及判定标准对选取的所有PCa组织标本均采用SABC法进行免疫组织化学染色，通过细胞着色状况观察肿瘤组织细胞中VEGF、KDR和RBM5的表达情况。微波法修复抗原后随即与下列3种抗体[VEGF单抗(clone 14-124，ABCAM,5 μg/ml)，KDR单抗(clone89115，R & Dsystem,25 μg/ml)和RBM5单抗(DO-7，DAKO，1:5)]4℃孵育过夜，然后滴加生物素化二抗，于37℃作用20 min时，再滴加SABC试剂备检，以DAB作底物观察显色。每次实验均用已知VEGF、KDR和RBM5表达阳性的PCa的细胞作阳性对照，非免疫血清代替一抗作阴性对照，结果判定标准：VEGF和KDR胞浆或胞膜呈棕黄色颗粒，胞核无着色为阳性，RBM5胞核呈棕褐色，胞浆和胞膜不显色为阳性，VEGF和RBM5与KDR和RBM5分别在胞浆和胞核中着色为共表达。

2 结果

2.1 PCa组织标本中VEGF、KDR和RBM5表达与病理特征的关系在196例PCa标本的组织细胞中VEGF、KDR和RBM5的阳性表达率分别为69.4%，56.1%和48.0%。胞膜浸润性PCa中VEGF、KDR和RBM5阳性表达率低于非胞膜浸润者(P<0.05)，细胞中等分化和分化不良阳性表达率与细胞分化好的比较，差异也有统计学意义(P<0.05,表1)。

表1 Pca患者VEGF、KDR和RBM5表达与病理特征的关系(%)

2.2 PCa 组织标本中VEGF和KDR表达情况除肿瘤血管内皮细胞外，肿瘤细胞中也存在VEGF和KDR阳性共表达。以VEGF表达与否将PCa患者分为两组，观察KDR表达情况，结果显示在136例VEGF表达阳性和60例无表达的细胞中，其阳性表达率分别为66.2%和33.3%，两者间的表达差异有显著统计学意义(P<0.01，表2)。

表2 PCa组织标本中VEGF和KDR表达间的关系(%)

2.3 PCa组织标本中RBM5和VEGF与KDR表达的相关性根据VEGF表达与否将PCa患者的组织细胞标本分为两组，分别检测RBM5表达状况，结果提示在136例阳性表达和60例无表达的细胞中，RBM5的阳性表达率分别为55.9%和30%。这表明VEGF和RBM5间的表达联系密切，其差异有统计学意义(P<0.05)。以同样的方法同时检测KDR和RBM5表达情况，结果表明在110例KDR表达阳性和86例无表达的患者中，RBM5阳性表达率分别为61.8%和30.2%，KDR阳性表达与RBM5水平的差异有显著统计学意义(P<0.01，表3)。

表3 PCa组织标本中RBM5与VEGF和KDR表达的相关性

2.4 PCa组织标本中VEGF、KDR和RBM5表达和临床患者的关系本组随访统计资料结果显示，与VEGF、KDR和RBM低水平表达者相比，高水平表达者具有明显转移倾向，发生远处转移的风险极高(表1)。而RBM5和VEGF或KDR共表达者其预后更差。在本组所有196例术后PCa中，136例VEGF或110例KDR与RBM5共表达者的5年生存率分别为71.3%(97/136)和75.5%(83/110)，60例VEGF或86例KDR与RBM5未共同表达者的5年生存率则分别达到91.7%(55/60)和91.9%(79/86)，前后两者比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。影响5年生存率的关键是PCa患者术后的局部复发和远处转移。而复发和转移是患者术后死亡的主要原因(见表4)。

表4 阳性表达者5年生存率比较

3 讨论

PCa属血管依赖型肿瘤，其生长转移离不开血管形成，因此，近几年来抗血管生成的靶向分子治疗已成为研究的热点之一[6]。随着研究的深入，人们普遍认为在肿瘤血管生成的过程中，VEGF及其受体KDR间相互传导的信号作用极其重要。VEGF不单刺激新生血管生成，还能使其通透性增强，VEGF的这种生物学功能主要是通过KDR完成的。以往几乎一直认为KDR主要在肿瘤血管内皮细胞表达，VEGF与KDR结合后以旁分泌方式诱导并促进血管形成，加速瘤细胞生长转移。然而Steiner等[7]在63例恶性胶质瘤患者中发现有45例出现VEGF/KDR过表达，Weigand等[8]在乳腺癌组织细胞表面存在的KDR可被外源性VEGF激活的报道以后，研究人员才开始真正关注VEGF和KDR相互间的信号传导作用，并试图明确瘤细胞内是否存在VEGF自分泌现象。我们的实验结果初步提示，VEGF一方面与其血管内皮细胞表面受体KDR结合，以旁分泌方式刺激新生血管形成，另一方面则与其肿瘤细胞表面受体KDR结合以自分泌方式诱导细胞增殖。

本实验数据显示，VEGF与KDR的阳性共表达率高达45.9%(90/196)，以往以VEGF为靶点的肿瘤抗血管治疗之所以未达到预期效果，极有可能是因为没有考虑到VEGF的自分泌现象。不过也有报道认为，对于极其复杂的肿瘤血管形成来说，也可能受到抑癌基因或原癌基因的影响[9,10]。由于RBM5基因是一个候选的肿瘤抑制基因，它编码一个核RNA结合蛋白，它是剪接体a复合体的组成部分。编码蛋白通过对包括抑癌蛋白p53在内的多个靶基因进行mRNA前剪接，在诱导细胞周期阻滞和凋亡中发挥作用。该基因位于肿瘤抑制区3p21.3内，可能在抑制肿瘤转化和肺癌等多种恶性肿瘤的进展中发挥作用。VEGF可能参与肿瘤血管形成，VEGF与KDR结合后，可通过旁分泌作用影响肿瘤血管生成，还可能通过自分泌方式调节肿瘤细胞本身的分化、增殖、迁移或凋亡等。因此，本实验同时检测VEGF、KDR和RBM5在PCa中的表达状况，结果发现这三种基因之间存在不同程度的相关性，其相关性具有统计学意义(RBM5 vs VEGF，P<0.05；RBM5 vs KDR，P<0.01)。

上述3种标志物在胞膜浸润型和分化不良癌的阳性表达率与非胞膜浸润型和分化良好癌的阳性表达率相比较中，差异也具有统计学意义(P<0.05)。提示同时检测VEGF、KDR和RBM5三种基因对了解包括PCa在内的其他不同种类的恶性实体肿瘤的恶性度，预测预后和指导后续随访治疗等方面具有积极意义。通过本研究可以推测，肿瘤抑制基因RBM5的表达水平越高，越能在前列腺癌发生发展过程中起到负性调控作用，降低肿瘤转移风险，提高患者生存率；相反，VEGF和KDR则起到正性调控作用，能增加肿瘤转移风险，降低患者生存率。尽管到目前为止RBM5如同野生型P53一样是否有突变倾向尚不清楚，但本研究显示，VEGF和KDR在PCa中的阳性表达率和表达水平均高于RBM5，其数据差异有统计学意义(P<0.05)，故在选择分子靶向治疗PCa时应特别重视不同靶点的多靶位联合治疗，尤其是要在抑制癌基因表达的同时，上调抑癌基因表达水平[11,12]。