一例大熊猫肺炎克雷伯菌与奇异变形杆菌感染的诊断

陈垚焱 刘颂蕊 苏小艳 耿 毅* 黄文俊 陈 欣 白明焕 程子瑄

(1.四川农业大学动物医学院，成都，611130；2.成都大熊猫繁育研究基地，四川省濒危野生动物保护生物学重点实验室，成都，610000)

大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)属哺乳纲(Mammalia)，食肉目(Carnivora)，熊科(Ursidae)，大熊猫属，被誉为“活化石”和“中国国宝”，属国家Ⅰ级保护动物，是世界生物多样性保护的旗舰物种。据第四次全国大熊猫野外种群调查，野生大熊猫划分为秦岭、岷山、邛崃山、大相岭、小相岭和凉山六大种群，33个相对独立的局域种群，总数不足2 000只[1]，表明大熊猫已形成较为稳定的种群，但其保护形势依然严峻。研究表明，野生动物种群数量的下降不仅受气候变化、栖息地破坏以及人类活动等因素的影响，同时疾病的危害也对种群数量的下降造成严重的威胁[2-3]。目前报道的大熊猫疾病有寄生虫病(包括蛔虫病、吸虫病和体外寄生虫病)[4]、细菌病(肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae、大肠埃希菌Escherichiacoli和铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa等)[5-8]和病毒病(犬瘟热病毒CDV与轮状病毒RV等)[8-10]等给大熊猫健康与生存造成严重影响。2018年7月，在四川某自然保护区发现1只死亡成体大熊猫，我们对其进行了病理学与病因学分析，旨在明确其死因，为更好地开展大熊猫保护工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

四川某自然保护区发现的1只死亡成年雄性大熊猫，体重52.9 kg。

1.1.2 主要试剂

福尔马林固定液，TSA培养基，BHI培养基(购于英国OXOID公司)，细菌基因组DNA提取试剂盒(购于北京天根生化科技有限公司)，扩增细菌16S rRNA基因通用引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)于生工生物工程(上海)股份有限公司成都分公司合成，2×TaqPCR Mastermix(购于北京天根生化科技有限公司)，ddH2O，反转录试剂盒(购于北京宝日医生物技术有限公司)，动物组织总RNA提取试剂盒(购于北京天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理剖检与病理组织学观察

对死亡大熊猫进行系统病理剖检，观察各器官、组织的大体病变。同时取心、肺、胃、小肠、大肠、肝、胰、肾、脾、淋巴结、脑与肌肉等器官，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，H.E.染色，显微镜观察。

1.2.2 病原学检测

1.2.2.1 细菌学检查

无菌操作从死亡大熊猫的肝、脾、心血、淋巴结及坏死肌肉等处取样分别划线接种于TSA与BHI平板，37 ℃恒温培养24—48 h，挑取形态大小一致的单个优势菌落在相应平板上再次划线培养，获得纯培养菌株，并观察菌落与菌体形态特征。

取对数生长期的新鲜菌液，离心收集菌体，参考试剂盒说明书提取细菌基因组DNA。采用扩增细菌16S rRNA 基因的通用引物PCR 扩增 16S rRNA基因，预期扩增片段大小为1 500 bp。PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后，送擎科梓熙(成都)有限公司测序。将分离菌株的16S rRNA基因序列与GenBank中已知核酸序列进行BLAST比对。采用DNA Star软件的Multiple Sequence Aligment程序进行多序列比对，用MEGA 6.0构建系统发育树。

1.2.2.2 病毒学检查

取死亡大熊猫的肝、脾、肾组织提取RNA，参考郭玲等[11]的方法进行犬瘟热病毒的特异性检测。参考雷燕等[12]的方法进行轮状病毒的特异性检测。

1.2.2.3 寄生虫检查

参考艾必燕等[13]的方法进行体外与体内寄生虫的检查。

2 结果

2.1 病理剖检

死亡大熊猫右耳皮肤4处开放性损伤，右肩部一深度约2.5 cm的溃疡损伤灶(图1-A)，右后肢掌第二趾垫缺损0.5 cm2，掌垫0.5 cm深溃疡灶2处。剥离皮肤确认无组织器官自溶后，发现死亡大熊猫右肩部肌肉呈蓝褐色(图1-B)，并有恶臭味，肩部溃疡处皮下肌肉坏死。腋下淋巴结、颈部淋巴结与颌下淋巴结等浅表淋巴结肿大，呈蓝褐色，切面色泽不均匀，质地变脆(图1-C)；胸肌与肋间肌萎缩，睾丸大小不对称，左侧大于右侧。心脏扩张，冠状沟血管扩张淤血，心室与心房内积血；肺门淋巴结肿大，呈紫褐色，肺萎缩，体积缩小，边缘锐薄，被膜皱缩，并见斑状出血(图1-D)。肝肿胀，呈紫黑色(图1-E)，胆囊扩张，胆汁充盈；脾萎缩，体积缩小，被膜皱缩(图1-F)；肾肿胀，色泽不均匀，切面见部分区域呈暗紫色(图1-G)，肾门淋巴结肿大，呈紫褐色；胰腺呈灰白色，轻度肿大；肠系膜淋巴结肿大，呈暗紫色(图1-H)，胃腔与肠腔内未见明显的异常，但黏膜易脱落。

图1 死亡大熊猫剖检病变Fig.1 Gross lesions of the dead giant panda 注：A：右肩部皮肤溃疡；B：右肩部肌肉呈蓝褐色；C：右侧腋下及颈淋巴结肿大；D：右侧肺斑块状出血；E：肝肿胀，呈紫黑色；F：脾萎缩，被膜皱缩；G：肾切面色泽不均，部分呈紫褐色；H：肠系膜淋巴结肿大，呈紫褐色 Note：A，skin ulcer in right shoulder.B，the muscles of the right shoulder were blue and brown.C，right axillary and cervical lymph node enlargement.D，hemorrhage in right lung.E，swelling in liver with purplish black.F，atrophy of spleen and the capsule was shrinking.G，the section of kidney was inhomogeneity in color，part of which is bluish brown.H，enlargement in mesenteric lymph nodes with bluish brown

2.2 病理组织学观察

病理组织学观察发现，死亡大熊猫心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、肌肉与肠道等组织器官都发生较明显的病理损伤，并在心、肝、肺与淋巴结等都发现大量细菌入侵。

心：心肌纤维表现为颗粒变性，肌间隙增宽，其间偶见细菌团块，并致心肌局部形成局灶性溶解坏死灶(图2-A)。

肝：局部区域肝小叶中央静脉与肝血窦扩增淤血(图2-B)，肝细胞较为广泛性颗粒与水泡变性，部分中央静脉与小叶间血管内见长短不一杆状细菌，且部分肝小叶内见细菌入侵，并致灶性坏死(图2-C)。

脾：被膜增厚，实质内大量结缔组织小梁增生，白髓区域缩小，红髓与白髓区淋巴细胞显著减少，红髓淤血，大量含铁血黄素沉着(图2-D)。

肺：部分区域肺泡壁毛细血管扩增淤血，肺泡腔内出现多少不等的红细胞、巨噬细胞及中性白细胞，并在部分血管与肺泡内发现大量杆状细菌入侵(图2-E)；另外，部分区域表现为肺萎陷(图2-F)，肺泡明显缩小，肺泡壁结缔组织增生。

肾：肾小囊内出现多少不等的蛋白渗出，肾小管腔内有蛋白样管型，肾小管上皮细胞广泛性坏死，肾间血管内见多量杆状细菌，肾组织内也见杆状细菌入侵，并引起入侵部位组织坏死(图2-G)。

骨骼肌(右肩部)：肌纤维肌浆凝固，肌横纹与纵纹消失，肌纤维坏死，肌间隙大量中性粒细胞、巨噬细胞浸润(图2-H)，并在肌间隙见多量入侵的蓝染细菌团块(图2-I)。

淋巴结：淋巴结血管腔内见多量杆状细菌，淋巴窦内多量渗出的浆液、巨噬细胞、中性粒细胞，同时有细菌的入侵(图2-J)；皮质区淋巴细胞广泛性坏死，同时有多量细菌入侵(图2-K)。

肠：十二指肠、空场、回肠、结肠与直肠黏膜上皮脱落，肠腺上皮变性、坏死(图2-L)。

图2 死亡大熊猫病理组织损伤Fig.2 Histopathological lesions of the dead giant panda 注：A：心肌间隙内细菌团块，肌纤维坏死；B：肝中央静脉与肝血窦淤血；C：肝小叶内细菌入侵，肝细胞颗粒变性；D：脾淤血，淋巴细胞减少，脾小梁增生；E：肺泡腔浆液渗出，细菌入侵，出血；F：肺萎陷；G：肾内血管细菌入侵，肾小管上皮坏死；H：骨骼肌坏死，肌间隙大量中性粒细胞与巨噬细胞浸润；I：侵入骨骼肌的细菌团块；J：淋巴结淋巴细胞坏死与细菌团块；K：侵入淋巴结的细菌；L：肠上皮坏死脱落，肠腺细胞变性、坏死 Note：A，bacterial mass in intermyocardial space，necrosis in myocardial fiber.B，congestion in hepatic central vein and hepatic sinus.C，bacterial invasion in hepatic lobules，granulosa degeneration in hepatic cells.D，congestion in spleen，lymphopenia and splenic trabecular hyperplasia.E，serous exudation，bacterial invasion，and hemorrhage in pulmonary alveoli.F，pulmonary collapse.G，bacterial invasion in renal blood vessels，necrosis in renal tubular epithelia.H，necrosis in skeletal muscle，massive neutrophil and macrophage infiltration in intermuscular space.I，bacterial mass in skeletal muscle.J，necrosis of lymphocytes and bacterial masses in lymph nodes.K，bacterial invasion in lymph nodes.L，necrosis and exfoliation of intestinal epithelia，degeneration and necrosis of intestinal gland

2.3 病原学检查

2.3.1 细菌学检查

2.3.1.1 细菌的分离与纯化

从死亡大熊猫的肝、脾、心血、淋巴结与坏死肌肉等处取样划线接种于 TSA 与 BHI平板，37 ℃恒温培养箱中培养 24—48 h，结果在平板上均出现2种菌落形态、色泽较为一致的优势菌。分别挑取单菌落在BHI平板进行划线，37 ℃恒温 24 h，对分离细菌进行纯化，获得纯化优势菌2株(SM1与SM2)。SM1在普通琼脂培养基上形成较大的灰白色黏液菌落，以接种环挑之，易拉成丝，为G-、无芽孢、两端钝圆的杆菌；SM2在普通琼脂培养基上形成以接种部位为中心的厚薄交替的波纹状菌苔，为G-，单个、成对或短链状排列的杆菌。

2.3.1.2 分离菌16S rDNA序列分析

提取纯化细菌 DNA 为模板，扩增出预期 1 500 bp 大小的DNA 片段，扩增产物经 DNA 纯化试剂盒纯化后，送擎科梓熙(成都)有限公司进行序列测定，将测得的 16S rDNA 序列在GenBank 中进行 BLAST 比对，结果发现2分离菌16S rDNA 序列分别与肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)的16S rDNA 序列同源性最高，达99%以上。采用DNAStar软件分别将2分离菌的16S rDNA序列与GenBank中同源性较高的16S rRNA序列进行多序列比对，并构建系统进化树(图4)。结果显示，在系统发育树上分离株菌SM1与Klebsiellapneumoniae聚为一支；分离株菌SM2与Proteusmirabilis聚为一支。由此鉴定2分离菌分别为Klebsiellapneumoniae与Proteusmirabilis。

2.3.2 病毒学检查

犬瘟热病毒和轮状病毒PCR检测结果均为阴性。

2.3.3 寄生虫学检查

未见蜱、虱等体外寄生虫；剖检死亡大熊猫的肠道和脏器也均未见大量蛔虫等内寄生虫。

3 讨论

病理剖检发现，死亡大熊猫身体具有明显的外伤，进一步的组织学检测发现肩部骨骼肌、肝、肾、肺与淋巴结内都发现大量细菌入侵，且这些组织与器官都发生明显的变性、坏死与炎性细胞浸润，从而导致相应器官功能障碍，尤其是心、肝、肾与肺损伤所致的多器官功能障碍应该是该例大熊猫的死因。病毒学检查犬瘟热病毒和轮状病毒均为阴性；寄生虫学检查肠道内有少量蛔虫，不足100条，不属于致病原因[14]；细菌学检查从死亡大熊猫肝、脾、心血、淋巴结及坏死肌肉等组织分离到细菌，表明死亡大熊猫发生了全身性感染。分离菌的16S rDNA序列分析表明，感染的细菌为肺炎克雷伯菌及奇异变形杆菌，这些细菌通过身体的外伤途径入侵致菌血症引起全身性感染是本例大熊猫死亡的病因。

菌血症指血液中出现微生物，多是细菌由局部病灶入血引起全身性感染。据国内外学者研究发现，肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌都有引起菌血症的相关报道。Bleich等[15]研究发现，肺炎克雷伯菌等机会性病原体会引起菌血症导致全身性感染，病理观察表现为全身性多组织器官损伤，并有大量细菌团块入侵。Wei等[16]建立了奇异变形杆菌机会性感染的小鼠模型，发现其感染能致小鼠全身性菌血症。本次病例的病理学观察结果与上述报道基本一致，表明肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌感染是本例大熊猫的组织器官损伤与致死的重要原因。

克雷伯菌(Klebsiellaspp.)是能引起多种动物患病的条件性致病菌，国内外先后从患病的马、牛、猪、鸡、鸭、麝鼠、珍珠鸡等动物体内分离到该菌[17-18]。在大熊猫自邬捷等[19]1988年首次从2例患出血性肠炎大熊猫体内和粪便中分离出作为致病菌的肺炎克雷伯氏菌后，该菌对大熊猫的危害与相关研究受到了关注[7，20-21]。肺炎克雷伯菌对大熊猫的致病在临床上分为肠炎型和败血型两种类型[17]，本病例表现为全身性感染，全身多组织器官变性与坏死，虽见肠黏膜上皮脱落，肠腺上皮变性、坏死，但未见明显肠炎表现，因此，本病例属于败血型。

奇异变形杆菌广泛分布于自然界、人与动物体表，是一种较常见的条件致病菌。P.m.在人、动物体内或体表的适宜环境生长并大量繁殖时，可诱发尿道炎、肾盂肾炎、中耳炎、菌血症及急、慢性腹泻、脊髓炎等多种疾病，严重时可致死[22]。2007年，王承东等[23]发现了一例雌性大熊猫生殖道感染奇异变形杆菌感染。奇异变形杆菌在大熊猫肠道较为常见，属肠道内的正常菌群，一般不会致病，只有在当其定居部位改变、机体抵抗力降低或菌群失调时可致病[24]。本病例中大熊猫的脾脏明显萎缩，淋巴细胞数量显著减少，表明其免疫力较为低下，可能是其易发生感染的重要原因。

对于本只大熊猫外伤形成的原因，根据现有的研究结果我们还不能做出较为确切的判定。Martinez等[25]的调查发现，在毗邻野生动物栖息地的农村，家养犬只可能会攻击野生动物，导致野生动物受伤，对野生动物生存造成潜在威胁；Chaudhary等[26]也发现，保护区周围的犬只不仅野生动物生存构成威胁，同时存在较高疾病传播的风险。由此可见，犬只对野生动物的生存与保护有重要影响，不但会攻击野生动物，而且还可能会传播疾病。尽管目前还未见犬只攻击大熊猫的案例报道，但也要引起关注，加强保护区周边犬只的管理。