HPLC法测定米力农的有关物质

于 峰，张曼红，田景振，刘建洋

(山东绅联药业有限公司，山东 济南 250000)

米力农是非洋地黄、非儿茶酚胺类强心药，是人工合成的第二代磷酸二酯酶Ⅲ抑制药，通过抑制磷酸二酯酶Ⅲ的活性增加细胞内cAMP的浓度，改变心肌细胞内外钙离子的转运，从而产生正性肌力作用，同时还通过提高血管平滑肌细胞内cAMP含量而具有扩血管作用，临床上适用于急性代偿性心力衰竭患者的短期静脉治疗[1-4]。本品由荷兰Sterling-Winthrop公司研究开发，1990年上市销售，仅用于静脉滴注，商品名Corotrop，Primacor[5]。本研究通过高效液相色谱法测定米力农的有关物质，此方法灵敏度高，专属性强，准确度高，可用于米力农的有关物质检查。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-10AT vp高效液相色谱仪(岛津SPD-10A vp紫外检测器)；岛津UV2600型紫外可见分光光度计；QUINTIX125D-1CN电子天平(赛多利斯公司)；FE-28台式酸度计(梅特勒-托利多)。

1.2 试药

米力农样品(自制，批号：200101、200102、200103)；米力农对照品(来源：中国药品生物制品检定所，批号：101065-201901，含量：按C12H9N3O计含量为99.0%)；米力农杂质A对照品(来源：中国药品生物制品检定所，批号：101066-201901，含量：99.2%)；乙腈(色谱纯，ASTOON，4 L/瓶)；水(市售纯净水，杭州哇哈哈哈集团)，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

取米力农与米力农杂质A对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中分别约含2 μg的混合溶液，作为对照品溶液。

取中间体I适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含2 μg的溶液，作为中间体Ⅰ溶液。

取中间体Ⅱ适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含2 μg的溶液，作为中间体Ⅱ溶液。

取起始原料4-甲基吡啶适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含2 μg的溶液，作为起始原料溶液。

取米力农杂质A、中间体Ⅰ、中间体Ⅱ、起始原料4-甲基吡啶和米力农各适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中分别约含2 μg的混合溶液，作为混合溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性

色谱柱为Waters C8色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)，以磷酸氢二钾溶液(取磷酸氢二钾2.7 g，加水800 mL溶解后，加三乙胺2.4 mL，用磷酸调节pH值至7.5)-乙腈(80∶20)为流动相，流速1.0 mL·min-1，柱温35℃，检测波长254 nm，进样量20 μL。结果表明，在选定的色谱条件下，可同时有效检出起始原料4-甲基吡啶、中间体Ⅰ、中间体Ⅱ、米力农和米力农杂质A，各色谱峰保留时间分别约为13.1、6.0、19.7、7.3和4.2 min，各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5，均能实现基线分离，色谱图见图1。

图1 专属性试验高效液相色谱图

2.3 专属性试验

分别取本品约20 mg，按表2中的破坏方法进行强制降解试验。取破坏后溶液，放冷后，加流动相稀释至10 mL，滤过，取续滤液作为溶液状态下各破坏供试品溶液。固体状态下按表2中的破坏条件降解后，加流动相配制成相同浓度的溶液，作为固体状态下各破坏供试品溶液。取各供试品溶液20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，各破坏试验同时做相应的空白试验。试验结果见表3。由试验结果可知，本品在高温、光照、酸降解条件下未见明显杂质产生；在碱降解条件下主要降解产物为米力农杂质A，占5.698%；在氧化状态下主要降解产物为米力农杂质A和氧化产物1，分别占3.497%和3.247%。主峰与杂质之间均能实现基线分离，表明该方法专属性良好。并根据降解前后峰面积计算物料平衡，结果见表3。

表2 强制降解试验方法

表3 强制降解试验结果(面积归一化法)

2.4 线性试验

分别取米力农对照品与米力农杂质A对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中分别约含20 μg的混合溶液。分别精密量取上述溶液0.5、2.5、5、7.5、10 mL，置50 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成系列浓度的对照品溶液。精密量取上述对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，以溶液浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，采用最小二乘法进行线性回归，同时计算定量限(LOQ)和检测限(LOD)，结果见表 4。结果表明米力农和米力农杂质A分别在0.199～3.978 μg·mL-1和0.201～4.024 μg·mL-1范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系。

表4 线性试验结果

2.5 精密度和稳定性

由两位分析人员在不同时间、不同设备上，分别平行测定6份供试品溶液，结果见表5。计算米力农杂质A和其他杂质之和分别为0.049%和0.017，RSD(n=12)分别为4.57%和2.55%。

表5 中间精密度试验结果

取本品，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含2 mg的溶液，作为供试品溶液；将供试品溶液室温放置8 h，并于0、2、4、6、8 h时，精密量取各溶液20 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表6。米力农杂质A各时间点RSD为1.31%，与0时相比，无显著性差异。其他杂质峰面积之和RSD为0.93%。结果表明，室温条件下，供试品溶液在8 h内基本稳定。

表6 供试品溶液稳定性试验结果

2.6 回收率试验

精密称取米力农杂质A对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中约含2 μg的溶液，作为对照品贮备液。

精密量取本品(米力农杂质A含量为0.049%)约50 mg共9份，分置于25 mL量瓶中。精密量取上述对照品贮备液5、10和15 mL，各3份，分别加入各个量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取米力农杂质A对照品适量，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1 mL中约含2 μg的溶液，作为对照品溶液。

精密量取上述各供试品溶液及对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表7。结果表明采用本法测定米力农杂质A准确度良好。

表7 回收率试验结果

2.7 样品测定

取三批自研产品(批号：200101、200102、200103)，按“2.2”项下的色谱条件进行试验，米力农杂质A按外标法以峰面积进行计算，其它杂质按主成分自身对照法计算，结果见表8。

表8 样品测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

根据合成工艺，米力农中间体Ⅱ[1-乙氧基-2-(4-吡啶基)-乙烯基甲基酮]在220 nm波长处的吸光度远小于在254 nm波长处的吸光度，而米力农及米力农杂质A在254 nm波长处均有较强的吸收。起始原料4-甲基吡啶和中间体Ⅰ[1-(4-吡啶基)-2-丙酮]均在254 nm波长处有较强吸收。综合考虑，选择254 nm作为本品有关物质检测用波长。

3.2 色谱条件

本试验以磷酸氢二钾溶液(取磷酸氢二钾2.7g，加水800 mL溶解后，加三乙胺2.4 mL，用磷酸调节pH值至7.5)-乙腈(80∶20)为流动相，等度洗脱，主峰与各杂质色谱峰之间均能实现基线分离，且各色谱峰纯度均能达100%。

3.3 杂质含量计算方法

本试验将杂质A作为已知杂质进行研究，其校正因子为1.0，为准确计算样品中杂质A的含量，确定采用外标法按峰面积计算其含量。