牛奶中抗生素残留检测的研究现状

马 娅，马丽娜，史俊杰，焦林宏，王红玉

(兰州石化职业技术学院，甘肃 兰州 730060)

牛奶因其营养成分齐全、营养价值高、易消化吸收等特点，被誉为“食品之王”，逐渐成为人们生活中不可或缺的一种食品。然而，奶牛饲养中为预防疾病常在饲料中添加抗生素，服用大剂量抗生素药物，获得的奶品中添加抗生素防止其腐坏[1]，这些因素均会导致抗生素在牛奶中残留，长期饮用含抗生素残留的牛奶不仅危害人类的健康, 同时由于抗生素对发酵乳中发酵菌种的繁殖产生抑制作用使其发酵异常从而影响奶制品的品质[2]。

世界卫生组织(WHO)在1979年就已经将抗生素列为污染物，之后各个国家都开始关注牛奶中抗生素残留检测，提出了不应检出抗生素的要求。 2001年中华人民共和国农业行业标准也规定了无公害食品-生鲜牛乳中不能检出抗生素。我国农业部在2001年10月发布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》，明确规定“新鲜牛乳中抗生素不得检出”。2002年发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定，奶中最高允许残留量(单位ng/L)标准是：新霉素为500；庆大霉素为200；林可霉素为150；四环素、土霉素、磺胺类等均为100[3]。但目前为止我国乳制品中抗生素残留量超标的现象仍然普遍存在。2002年，马群飞等[4]对福建省几个城市的生牛乳中抗生素残留情况作了调查，调研发现尤溪市、晋江市、福州市和龙岩市所采集的生牛奶样品中，抗生素阳性率分别为50%、25%、19.5%和9.7%。在2006年[5]，在我国的一些大城市(西宁、南宁、北京等)进行了奶制品质量调研，结果显示不合格项目中，抗生素残留位居第一。目前乳制品中抗生素残留的问题不可小觑，为保障使用乳品的安全和卫生，相关部门须加强管理且严格检测。牛乳中抗生素残留的常用的检测方法有：微生物检测法、理化检测法和免疫法。

1 微生物检测法[6]

微生物检测法也叫微生物抑制试验(Migration Inhibition Test)可以定性或定量的测定牛乳中抗生素残留量，基于某些抗生素能够对微生物的生理机能及繁殖代谢的抑制作用。微生物检测法的基本原理，若存在抗生素会抑制牛奶中培养过微生物的繁殖生长，培养基不会出现浑浊，指示剂的颜色也不会发生变化。微生物检测因其检测价格低廉、检测过程简捷、检测结果可靠等特点，是牛乳中抗生素残留检测的一种广泛且经典的方法。常用的微生物检测法有：纸片法(PD法)、TTC 法、牛乳活性检测法等。

1.1 纸片法

常用的纸片法：枯草杆菌法、嗜热脂肪芽孢杆菌法。两种方法的检测过程基本一样，均选用不同的菌种检测牛乳中的青霉素(或β内酰胺类抗生素)。在培养基上接种菌种(枯草杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌)，放入吸满被检乳品的圆形滤纸片，然后放入一张对照圆纸片，该纸片是含有标准抗生素的阳性纸片。若牛乳中无抗生素，微生物的繁殖生长，滤纸圆片不形成无抑菌圈，为阴性。反之，牛乳中存在抗生素或者抑菌物质，纸片上形成抑菌圈，为阳性。为了确定测定结果非假阳性及阳性物质是青霉素(或β内酰胺类抗生素)，加热乳品并加入青霉素酶测定，没有抑菌圈说明奶品中存在青霉素(或β内酰胺类抗生素)。如果仍出现抑菌圈，说明其他化合物导致了抑菌作用。但是当抑菌圈变小且没完全消失，说明不止一种抑菌化合物存在于奶样中。该检测方法的检测限为 0. 01 IU /mL。

1.2 嗜热链球菌抑制法(TTC法)

我国于2008年颁布并实施了《鲜乳中抗生素残留检测》国家标准(GB4789.27-2008)，该标准规定鲜乳中抗生素残留的检验方法：嗜热链球菌抑制法(TTC)和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法。这两种方法检测过程基本一致，均可测定牛奶中抗生素的残留量。

TTC检测过程如下：乳品经80℃的杀菌后，添加菌种(嗜热链球菌)，培养一段时间菌种生长繁殖，加入TTC，该样品中不含抗生素或抗生素含量低于检测值，菌种继续增殖，指示剂TTC被还原成红色。相反，如果样品中抗生素含量高于检出值，抗生素抑制菌种繁殖，TTC不被还原，保持无色。该方法测定几种抗生素的最低检出量如表1所示。

表1 TTC检测方法测定几种抗生素的最低检出量

1.3 牛乳活性检测法

向乳品中加入适量发酵剂，发酵后乳品的pH值降低，牛乳中若有抗生素残留，则发酵剂的繁殖被抑制，pH值的变化不大。牛乳活性检测法过程：取适量的牛奶进行一段时间的加热灭菌，然后迅速冷却降至42℃后，加入发酵剂，经搅拌后测pH值，一般在6.4左右。再将样品于42℃保温培养一段时间，每30 min 检测1次pH值，测定三次。检测过程中，90 min内乳品的pH值下降至5.7，属正常的发酵活性实验，代表乳品呈阴性，无抗生素残留。如果3次检测结果的pH值不变均在 5.7以上，表明存在抗生素，为阳性。据研究乳品中抗生素残留量达到 0.015～0.05 U/mL之间时，会抑制菌类的发酵速度，因而需借助做小样的办法确定是否抗生素残留。

2 理化检测法

理化检测法特点是：高分离效率、高灵敏度、稳定可靠的测定结果等，是牛奶中抗生素残留量确定的一种精确检验方法。该方法对样品进行一定处理之后要借助实验室的精密仪器测定抗生素的含量。虽然这种方法具有很高的精确度，但是该检测方法对检测样品的前处理比较复杂。常用的理化检测方法：高效液相色谱法(HPLC)和色谱质谱联用技术。

2.1 高效液相色谱法

高效液相色基于气相色谱理论通过高压泵、高效固定相及高灵敏检测器等设备，快速、高效、自动化检测牛乳中抗生素残留量，是广泛使用的一种理化检测方法。高效液相色谱法测定步骤比较复杂，包括样品处理、残留抗生素分离和检测。

样品处理步骤：样品提取、脱蛋白、离心、层析柱净化、衍生化等。样品提取常用的提取试剂是水和酸化有机溶剂，脱除样品中的蛋白和萃取残留。加拿大HAL用钨酸钠、硫酸和水提取组织中青霉素同时并脱掉蛋白质，对牛乳中的青霉素脱除效果非常好。样品提取后可采用一些有机溶剂、无机酸及超滤法进行蛋白质沉淀。为减少非极性物质的污染，Bioson等用硫酸和钨酸钠把青霉素萃入水相，得到较为干净的水提取液。一般来说，萃取得到的水或有机提取液中待测物浓度低，而且含有一些共萃取物导致无法准确测定痕量目标物，因为共萃取物会损害仪器，增加检测噪音。为避免出现以上问题，需要对待测物进行净化与浓缩。常用的净化和浓缩方法：免疫亲和色谱法、离子交换法和固相萃取法。

残留组分的分离方式主要包括正相、反相和离子交换三种方式。反相高效液相色谱法具有短时、高效且可在水系统中完成的优点而被广泛应用。残留抗生素被分离后，使用紫外检测器或荧光检测器检测。紫外检测器价格低、选择性好的特点，能满足抗生素残留的检测要求。但是如瓶中抗生素含量低，背景干扰比较严重，常采用柱前或柱后的衍生反应来提高其灵敏度。彭莉采用HPLC法测定了牛奶中氯霉素的残留量，通过简单的样品前处理，达到了较高的回收率(平均回收率94.8%)，而且检测结果精密度高，可作为牛奶中氯霉素残留检测的方法。

2.2 色谱/质谱联用法

色谱/质谱联用法是牛乳中抗生素残留分析检测的趋势，常用的色谱/质谱联用法：薄层色谱/质谱法(TLC/MS)、气相色谱/质谱法(GC/MS)、液相色谱/质谱法(LC/MS)、液相色谱/核磁共振法(LC/NMR)、超临界流体/质谱法(SFC/MS)等。液相 /质谱(LC/MS)联用法用液相色谱实现样品的有效分离，提供保留时间，用质谱仪分析液相色谱仪的不同洗脱成分，完成定性和定量分析。色谱/质谱联用法具有高效、可靠、高通量等特点，可以同时完成分离、定性及定量检测，广泛应用于确证性分析。然而由于色谱/质谱联用法所用仪器价格贵，检测费用高，远不如HPLC法普及。

3 免疫法[8]

免疫法因其具有检测所需样品量少、检测速度快、分析费用少、灵敏度高等特点被广泛应用于现场监控和筛选样品。免疫分析法是抗原、半抗原及抗体发生特异性的结合，即抗原/抗体免疫反应，在此基础上进行的生化检测方法。目前免疫检测法分为两大类：(1)相对独立的免疫检测法，如放射免疫标记技术(RIA)和酶联免疫法(ELISA)等；(2)联用法，将免疫技术和其他理化检测技术(如气相色谱、液相色谱)相结合测定抗生素残留，典型测定方法：免疫亲合色谱(IAC)。免疫法具有高选择性、高灵敏度可以用来净化气相色谱(GC)、液相色谱(LC)的样品，色谱技术检测效快速、检测结果准确，将两种方法相结合能达到分析过程简捷、分析成本低廉，待测物范围广的目的。目前，磺胺类、链霉素类、内酰胺类、喹诺酮类以及四环素类等抗生素已经建立了免疫测定法。

最常用的免疫技术是ELISA法，固相载体表面吸附已知的抗原或抗体与酶标记的抗原或抗体反应，通过酶与催化底物显色测定待测物含量。常用的标记酶：即辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。ELISA法具有高灵敏度、强特异性、低检测费用、快检测速度、低毒性等优点，广泛应用于奶牛养殖场和奶制品生产企业中抗生素的快速筛查检测方法。ELISA法能完成40个以上样品同一种或一类抗生素的测定，此法对结构相近的物质存在交叉反应，无法准确测定小分子及稳定性差的物质。因此，为防止假阳性结果，ELISA法筛查后的阳性样品，还需采用其他理化检测方法确证。

4 我国在牛奶中抗生素使用的检测方法及现状

目前我国在生产管理上常用的抗生素残留筛查检测方法主要有TTC法和SNAP法(又称双流向酶联免疫技术)。国标TTC法可同时测定几种能抑制菌种生长抗生素含量在国内虽应用广泛但因其检测时间长、操作复杂、不易标准化而受到局限。SNAP法获美国食品药品监督管理局(FDA)认可，利用酶化学反应的敏感性和抗原抗体的免疫反应，在几分钟能快速检出牛奶中的β-内酰胺类抗生素，敏感性高、特异性好，但是SNAP法需要购买专门的试剂和试剂和仪器，导致其检测成本增加。针对该问题，目前国内专家和学者都在积极研制基于TTC法快速检测试纸检测技术。

快速检测试纸法操作过程简单、检测速度快、携带方便是乳制品中抗生素残留筛查的发展趋势。快速检测试纸使用时，将牛乳滴加或者浸入试纸，在几分钟内检测出牛乳中是否含有残留抗生素。这种检测方法一般用于其他测试之前，作为快速筛查测试，当显示结果为阳性需要采取其他新的测试。2019年[10]刘广源等以TTC法为基础，研制了一种能快速检测牛乳中氯霉素残留的试纸，对牛奶中氯霉素的残留进行快速，有效的检测。目前，该方法还处于实验室的研究阶段，它的进一步开发及商业应用还需要很长一段时间。