养鸡专业合作社四种病毒性疫病检测分析

朱丽华，王超，宋建领

(1.玉龙县龙蟠乡畜牧产业发展服务中心，云南 玉龙 674112；2.玉溪市红塔区动物卫生监督所，云南 玉溪 653100；3.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224)

养鸡场呼吸道和消化道疫病是春季最为常见鸡病，尤其是饲养环境差、饲养密度高的土杂鸡场易发生呼吸道和消化系统疫病。2020年4月份，云南省昆明市某养鸡专业合作社饲养的土杂鸡，出现以呼吸系统为主要临床症状的疫病，剖检发现部分鸡出现肝脏肿大和心包积液。为了解该养鸡专业合作社主要疫病流行情况，结合临床兽医怀疑疫病情况，对该养鸡专业合作社的9户农户养殖的鸡采集样品，进行新城疫、禽流感、传染性喉气管炎和安卡拉病原检测，现将检测结果报道如下。

1 材料

1.1 病料

2020年4月在云南省昆明市某养鸡专业合作社采集9户(每户分别采集5只发病鸡)鸡喉气管、肺脏、脾脏、肝脏等组织样品，冷藏送实验室进行检测。

1.2 主要试剂

RNA/DNA核酸提取试剂盒、RT-PCR 试剂盒、PCR 试剂盒和 DL2000 分子量标准等均购自大连宝生物公司。

1.3 主要仪器

超净工作台(型号为LA2-4A1)，购自ESCO公司；PCR仪(型号为9700)，购自美国ABI(Applied Biosystems Inc)公司；凝胶成像系统(型号为2000)，购自美国伯乐BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 病料处理

将每户采集的组织样品混合剪碎，按1:5的比例加入灭菌PBS研磨，研磨的混合物反复冻融3次，3000r/min离心10min；取上清液提取核酸。

2.2 DNA的提取

按照RNA/DNA核酸提取试剂盒说明书，分别提取上清液的RNA/DNA核酸。

2.3 引物合成

根据国内外已发表的禽流感病毒基因序列、新城疫病毒基因序列、传染性喉气管炎病毒基因序列和安卡拉病毒基因序列及相关文献[1-4]，合成检测引物NA/NB、M1F/M1R、ILTF/ILTR和FAdVF/FAdVR，详细情况见表1。

2.4 病原核酸检测

病毒通过RT-PCR、PCR方法分别检测新城疫病毒、禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒和安卡拉病毒核酸。新城疫、禽流感检测反应总体积为20μL：2×1 Step Buffer 10 μL，RNase Free ddH2O 6.2 μL，Enzyme Mix 0.8 μL，上游引物(20 pmol/5μL)0.5 μL，下游引物(20 pmol/5μL)0.5 μL，模板RNA 2 μL。RT-PCR反应条件为50 ℃反转录30 min， 94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7min。传染性喉气管炎、安卡拉检测反应总体积为20 μL：Premix TaqTM 10 μL，ddH2O 7 μL，上游引物(20 pmol/5μL)0.5 μL，下游引物(20 pmol/5μL)0.5 μL，模板DNA 2 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min。1.2%琼脂糖凝胶，100 V电泳30min，观察PCR扩增结果。

表1 PCR、RT-PCR引物序列

3 结果

3.1 新城疫检测结果

9户发病鸡样品新城疫病原核酸检测结果均为阴性(图1)。

M.DNA标准分子量；1.新城疫阳性对照；2.阴性对照；3-11.样品新城疫核酸阴性。

3.2 禽流感检测结果

9户发病鸡样品禽流感病原核酸检测结果均为阴性(图2)。

M.DL 2000 分子量标准；1-9.样品禽流感核酸阴性；10.阴性对照；11.禽流感阳性样品。

3.3 安卡拉检测结果

9户发病鸡样品安卡拉病原核酸阳性2份，安卡拉病原核酸阴性7份(图3)。

3.4 传染性喉气管炎检测结果

9户发病鸡样品传染性喉气管炎病原核酸阳性6份，传染性喉气管炎病原核酸阴性3份(图4)。

M.DNA标准分子量；1.安卡拉阳性对照；2.阴性对照；3-4.样品安卡拉核酸阳性；5-11.样品安卡拉核酸阴性。

M.DNA标准分子量；1.传染性喉气管炎阳性对照；2.阴性对照；3-7.样品传染性喉气管炎核酸阳性；8.样品传染性喉气管炎核酸阴性；9.样品传染性喉气管炎核酸阳性；10-11.样品传染性喉气管炎核酸阴性。

3.5 病原核酸检测结果统计

9户发病鸡样品中，新城疫、禽流感、传染性喉气管炎和安卡拉病原检测结果表明，9户发病鸡样品中，传染性喉气管炎病原核酸阳性6户，阳性率为66.7%，安卡拉病原核酸阳性2户，阳性率为22.2%，安卡拉病原核酸阳性样品同时传染性喉气管炎病原核酸也是阳性。

4 讨论

养鸡专业合作社的规范和健康发展，对农民增收、农村稳定以及社会和经济的持续发展具有较大的影响。但是很多养鸡专业合作社存在饲养密度过大、疫病防控不够科学规范[5]，导致部分养殖户鸡病不能很好控制。在云南由于养鸡专业合作社的养鸡户分布不同的村庄，村庄与村庄距离也较远，各村庄的自然环境和气候条件存在较大差异，在鸡病防控上也不能完全同步进行，导致养鸡专业合作社的不同养殖户发病情况存在较大差异。本次检测的一个养鸡专业合作社的9个养殖户，病原检测结果存在传染性喉气管炎和安卡拉混合感染、传染性喉气管炎感染、病原核酸阴性三种方式，虽然同为一个养鸡专业合作社，但是不同养鸡户的防控措施应该根据检测结果，制定个性化的防控措施才能获得比较好的防控效果。在养鸡密度越来越大的背景下，不论日龄大小表现呼吸道症状的疾病最为常发，除了疫病因素外，提示养鸡户应加强饲养管理和环境控制，才能很好的防控鸡场主要疫病的发生，与王建聂等报道云南省土杂鸡呼吸系统疫病病因分析结果一致。随着生物技术的发展和疫苗质量的提高，近几年来在大剂量和高频率使用新城疫和禽流感疫苗免疫的情况下，该病的发生和流行很少[6，7],本次对该养鸡专业合作社鸡病监测也未检测到新城疫和禽流感病原核酸阳性。传染性喉气管炎是由传染性喉气管炎病毒引起鸡的一种急性呼吸道传染病，该病1925年在美国首次发现[8]，随后在世界各地都有发生，主要表现为呼吸困难、咳出带有血液的分泌物，喉头和气管被堵塞等症状[9]，没有有效药物治疗，给养殖场造成巨大的经济损失。本次检测结果证明该养鸡专业合作社主要以传染性喉气管炎为主要感染病原，通过传染性喉气管炎疫苗紧急免疫，减少了该养鸡专业合作社疫病的发生率。禽腺病毒(fowl adenovirus, FAdV)4 型为禽腺病毒中致病性最强的[10]，是引起近年来在我国暴发的以心包积液和肝炎为主要特征的病毒性传染病主要病原，给我国的养禽业造成巨大的经济损失，因为1987年巴基斯坦的安卡拉地区首次暴发该病，所以通俗称为安卡拉病。1989年后该病在世界范围内流行，2013年在我国散在发生[11]，2015年在我国大面积暴发[12-14]，2016年本实验室在云南省石林县肉鸡群首次检测到安卡拉病原核酸后，每年都能在云南鸡群中检测到安卡拉病原核酸阳性样品，本次检测样品中安卡拉病原核酸阳性率为22.2%，说明安卡拉病仍然在该养鸡专业合作社存在，在防控鸡传染性喉气管炎感染的同时，也要加强鸡安卡拉病的防控。