基于基因芯片技术对椎间盘退变关键基因鉴定分析

李胜吾，蔚浩，戴国钢

(四川省骨科医院，四川成都 610041)

腰痛是临床常见病和多发病，严重影响人们的生活质量并带来较大的经济负担[1-4]。大量研究发现，腰痛主要病因是椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration,IDD)[2, 5]。IDD发生率随着年龄的增长而增加，60岁以上无症状者中，90%会出现IDD[6]。研究发现，IDD涉及遗传、机械和生物等多因素。然而，其确切机制尚未完全阐明。

2015年，Kazezian等[7]使用基因芯片获得纤维环(annulus fibrosus,AF)和髓核(nucleus pulposus,NP)的基因表达谱。在本研究中，为了深入了解IDD的分子机制，笔者基于生物芯片数据鉴定了退行性AF和退行性NP与非退行性同类组织中的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。本研究还收集了8名IDD患者和8名健康志愿者的全血(whole blood,WB)进行生物芯片信息分析，以确定IDD患者WB中的DEGs，并且用实时荧光定量PCR验证了部分DEGs。

1 资料与方法

1.1 椎间盘生物芯片数据

基于Affymetrix GPL17810平台(HG-U133_Plus_2)的芯片数据集GSE70362从基因表达综合数据库下载而来(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。该数据集包含24个髓核和24个AF的尸体组织样本基因表达数据，由36位年龄21-82岁捐赠者提供。本研究下载了原始信号强度数据的CEL格式文件和IDD的汤普森分级信息[8]。我们将原始的探针名转换为基因名，丢弃任何未被识别的探针。对于具有多个探针的基因，只有具有最高差异倍数的探针被保留。在24个NP和24个AF样本中，各有8个汤普森一级或汤普森一至二级的样本被认为是非退变性的，各有16个分类为汤普森二至五级的样本被认为是退变性的。

1.2 识别AF和NP的DEGs

使用Genespring GX 11.5软件(美国安捷伦科技公司生产)识别DEGs。使用RMA(Robust multi-array average)算法对原始数据进行预处理，配对t检验的阈值P值为0.05，差异倍数(fold change,FC)为1.5，以鉴定退行性和非退行性AF、NP样本之间的DEGs。对于具有多个探针的基因，只保留具有最高FC的探针。

1.3 人类WB采集

WB样本于2018年4月～2018年8月在四川省骨科医院采集。本研究招募了8名患者，其中4名男性和4名女性，年龄33～60岁，经磁共振成像确诊为椎间盘退变(DD)；另有8名志愿者，其中4名男性和4名女性，年龄19～23岁，没有下腰痛或坐骨神经痛的临床证据。在上午7:00～7:30之间，从每位受试者的左肘正中静脉抽取10 mL的空腹全血。所有WB样本立即置于静脉真空采血管全血RNA管(美国BD)中于-20℃保存，72 h内送上海博豪生物科技有限公司进行基因芯片杂交。

1.4 WB的基因芯片数据分析和WB-DEGs的鉴定

基因芯片数据分析使用安捷伦SurrPress G3人类基因表达生物芯片8×60 K在上海博豪生物科技有限公司的安捷伦基因芯片扫描仪平台上进行扫面分析，遵循安捷伦科技有限公司(美国加利福尼亚州)的标准操作流程。利用R语言的limma包对芯片扫描得到的原始数据进行归一化处理。采用分位数算法，对信号值进行Log2归一化处理。t检验的阈值P值为0.05，FC值为1.5，以鉴定WB-DEGs。对于具有多个探针的基因，只保留具有最高FC的探针。WB基因表达谱的完整数据集已上传到GEO数据库，GSE124272。

1.5 常见DEGs总RNA提取、cDNA合成及实时荧光定量PCR检测

用实时荧光定量PCR检测NP、AF和WB中常见DEGs的表达。按照说明，使用PX血液RNA提取试剂盒(美国OMEGA)提取和纯化总RNA。使用逆转录反应试剂盒(日本TOYOBO)将每个RNA样品逆转录为cDNA，随后用cDNA进行实时荧光定量PCR。基因表达水平的量化使用7500HT序列检测系统(美国ABI)和Power SYBR Green PCR Master Mix预混液(美国ABI)。用引物表达法(v3.0.1)设计特异基因的引物，由上海生丁生物工程股份有限公司合成。以β-肌动蛋白基因为内参基因，用2?傆bΔCt方法将基因表达水平与β-肌动蛋白基因进行归一化。

1.6 统计学分析

实时荧光定量PCR数据由均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 6.0软件(美国加利福尼亚州圣地亚哥GraphPad软件有限公司生产)进行t检验。P<0.05 认为有统计学意义。

2 结果

2.1 DEGs

AF、NP、WB三组差异表达基因概况如表1所示。三组22个共同的差异表达基因。

表1 AF、NP、WB中DEGs概况

2.2 常见DEGs的实时荧光定量PCR

用WB进行蛋白二硫键异构酶A4(protein disulfide isomerase family A member 4, PDIA4)、肽基脯氨酰顺反异构酶11(FK506 BINDING PROTEIN 11, FKBP 11)、外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶4(ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 4, ENPP4)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2, SOD2)和肌动蛋白结合蛋白LIM1(actin binding LIM protein 1, ABLIM1)实时荧光定量PCR验证基因芯片杂交结果。用WB进行的实时荧光定量PCR结果与基因芯片杂交结果一致，证明了基因芯片结果的可靠性(图1 A-E)。椎间盘退变(IDD)患者WB中PDIA4、FKBP11和ENPP4的表达水平明显低于健康志愿者，而SOD2的表达水平明显高于健康志愿者。结果表明，PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2的基因表达水平在患者组和志愿者组之间存在显著差异(P<0.05)。PCR引物均列于表2中。

图1 PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2、ABLIM1在椎间盘退变(IDD)患者与健康志愿者WB中表达水平比较

表2 用于实时荧光定量PCR的引物序列

3 讨论

基因芯片技术目前已逐渐被运用于椎间盘退变领域的相关研究，为椎间盘退变的发病机制研究起到重要的推动作用[9]。以往的研究大多集中在退行性和非退行性AF或NP或整个椎间盘组织之间的DEGs方面，而这些组织只能通过手术获得。本研究通过全血分析出退变椎间盘患者与健康人之间存在DEGs，且这些差异基因与AF和NP的差异基因既有部分重叠，也有差异，这一结论提示，今后在椎间盘退变相关疾病生物学治疗上，不能只局限于椎间盘局部组织的取样和分析，还要考虑不同组织的基因表达可能存在差异。全血与椎间盘组织存在共同的DEGs，在条件有限情况下，可以优先选择操作更为简便的抽血进行取样分析。

本研究鉴定出846个AF-DEGs、902个NP-DEGs和862个WB-DEGs，其中有22个共同的DEGs。用实时荧光定量PCR验证椎间盘退变患者全血中PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2、ABLIM1基因的表达水平，PDIA4、FKBP11和ENPP4的表达水平明显低于健康志愿者，而SOD2的表达水平明显高于健康志愿者。

Schubert等[10]通过全基因组表达分析鉴定了5个AF和6个NP生物标志物，但在本研究的全血中未观察到这11个生物标志物的异常表达。Guo等[11]比较退行性椎间盘和非退行性椎间盘的基因表达谱，发现有35个FC大于2的DEGs在AF-DEG和NP-DEG间重叠。在这35种常见的DEGs中，只有具有LIM结构域的锌指蛋白185包含在本研究FC为1.5的DEGs中。Kazezian等[12]鉴定了17个FC大于1.5的退变AF生物标记物，但在本研究所鉴定出的AF-DEGs中未观测到这些生物标志物的异常表达。Zhang等[13]比较椎间盘退变患者外周血单核细胞与非椎间盘退变者外周血单核细胞的基因表达谱，共鉴定出62个DEGs，其中上调基因39个，下调基因24个，在这39个上调的DEGs中，人膜联蛋白A3(Annexin A3)、组织蛋白酶抗菌肽(cathelicidin antimicrobial peptide, CAMP)和白介素1β(interleukin 1 beta, IL-1β)在本研究中椎间盘退变患者全血里有所上调，但细胞周期调控蛋白Cyclin B1和肌间蛋白2(Myomesin 2, MYOM2)表达有所下调，在我们所鉴定出的WB-DEGs中没有发现他们研究报道的24个下调基因。

随着对椎间盘退变机制的认识深入和分子生物学技术不断进步，基因治疗在改变椎间盘细胞代谢和生物力学性能方面逐渐开展。基因治疗的目的是将外源性 DNA或 RNA转染至靶细胞，通过外源基因表达对靶细胞有利的蛋白产物或沉默特定基因减少有害产物生成，使靶细胞恢复正常的形态功能[14]。

本研究发现椎间盘退变患者全血中差异基因PDIA4、FKBP11和ENPP4的表达水平明显降低，而SOD2的表达水平明显增高，通过国内外文献数据库查阅，目前尚无PDIA4、FKBP11和ENPP4与椎间盘退变相关性的研究报道。PDIA4属于蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)家族，PDI家族主要在促蛋白折叠、翻译后修饰上发挥重要作用，与未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)密切相关，而UPR与多种疾病如糖尿病、神经退行性疾病、肿瘤等发生发展密切相关，PDIA4主要在细胞内质网中表达，目前对于PDIA4生理学功能研究并不透彻[15]。FKBP11是肽基脯氨酸顺异异构酶家族成员之一，也与UPR密切相关，可保护细胞免受炎性反应损伤[16]，炎性反应在椎间盘退变的发生和发展中起重要作用[17-20]。笔者推测FKBP11可能在椎间盘退变中参与炎症保护。ENPP4的生物学功能也尚不明确，有研究报道其在巨噬细胞内表达，具有抗肿瘤效应和保护细胞降低细胞毒性反应[21]。关于SOD2与椎间盘退变的关系，目前已有一定的研究进展。椎间盘退变是伴随着氧化性损伤和炎性反应而加速的衰老过程[22-24]。椎间盘退变过程中，血管向椎间盘内生长[25-26]，由此形成的新生血管使椎间盘的无血管组织暴露于高氧张力[27]。SOD2将超氧自由基转化为H2O2，通过抗氧化剂酶将其分解为无害的H2O和O2[28-29]。过度的氧化反应通过诱导细胞因子和趋化因子表达可引起蛋白质、DNA和细胞膜损伤，与细胞炎性反应相关[30-31]。SOD2在椎间盘退变过程中可能通过抗氧化和抗炎机制保护椎间盘。

本研究发现，人全血中的PDIA4、FKBP11、ENPP4、SOD2是椎间盘退变的潜在标志物，这些基因可能对椎间盘退变的机制研究和生物学治疗提供了重要的依据。今后需要开展进一步研究以确定这些基因在椎间盘退变过程中的具体作用机制。由于椎间盘退变与年龄密切相关，为了尽量避免椎间盘退变可能出现在健康对照组，本研究招募了年轻人作为志愿者，不排除年龄可能会影响基因表达检测结果，因此需要后续研究再次验证。