3D打印技术在小鼠主动脉缩窄模型影像学评价中的应用研究

徐臣年，刘 洋，丁 鹏，王晓武，马燕燕，马继鹏，李兰兰，杨 剑

肥厚型心肌病及主动脉弓缩窄是常见的结构性心脏病，常导致心功能下降、心力衰竭，严重者心源性猝死风险极高，两种疾病均有心肌肥厚的病理表现［1－2］。主 动 脉 缩 窄（transverse aortic coarctation，TAC）致心肌肥厚是建立肥厚型心肌病的动物模型方法之一，用于研究心肌肥厚致病机理、筛选具有治疗作用的药物。以往主动脉缩窄模型检测通过小鼠心脏超声检测心功能、血清生化指标等进行判断，3D打印技术的出现并与医学心血管研究相结合，建立了一种新的更直观的影像学评估方法［3－4］。随着心血管介入技术的不断发展，尤其是近年来逐步兴起并成熟的结构性心脏病的介入治疗——经导管瓣膜置换术、主动脉覆膜支架植入术、瓣周漏介入封堵术等，需要介入术者充分了解患者术前病变部位的解剖结构，3D打印技术可以个体化的复制病变部位解剖结构，精确模拟制作可视化三维模型，对于患者术前评估、模型评估具有重要意义［5－8］。本文通过利用3D打印技术对TAC模型主动脉重建，探讨3D打印技术在小鼠主动脉缩窄模型评价中应用的可行性及有效性。

1 材料与方法

1.1 材料 10周龄C57BL／6雄性小鼠20只购自空军军医大学实验动物中心，超高分辨率小动物超声影像系统Vevo2100购自加拿大Visual Sonics公司，小动物Inveon Micro CT购自德国西门子公司，光学显微镜购自日本奥林巴斯公司，Form2打印机购自美国Formlabs公司，3D打印树脂材料Clear V4（透明）购自美国Formlabs公司，PBS缓冲溶液，碘普罗胺注射液（优维显370）购自德国Bayer公司，Mimics 21.0软件、3－Matic软件均购自比利时Mate⁃rialise公司。蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂均购自美国Sigma公司，抗GAPDH、抗β－肌球蛋白重链（β－MHC）抗体、抗心房钠尿肽、抗脑型心房钠尿肽抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，山羊抗兔、山羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥公司，Minivent 845小动物呼吸机购自美国Harvard Apparatus公司。

1.2 分组及模型建立 TAC组经异氟烷麻醉后，将小鼠固定于操作台，行气管内插管后，连接小动物呼吸机辅助呼吸机麻醉。于胸骨上切迹处剪开皮肤，作1 cm左右纵行切口，剪开胸骨，胸廓扩张器撑开切口，分离胸腺等组织，清晰显露主动脉弓部，于主动脉弓部第一、第二分支之间部位穿7－0 silk线，用丝线将主动脉与预置的25 G针头共同结扎后撤出针头，逐层关胸。Sham组采用纵劈胸骨术式，逐层分离组织至主动脉弓后，不作处理，逐层关胸。

两组小鼠饲养28 d后，进行取材及检测。

1.3 主动脉超声检测 C57小鼠经异氟烷麻醉后，胸腹部脱毛后固定于Vevo 2100超声影像系统的操作台上，四肢接触操作台心电图电极，小鼠口鼻部罩管连接麻醉仪，于小鼠胸前区涂抹适量超声耦合剂，将MS400超声探头将鼠板向操作者右侧倾斜约30°，选择Ao Arch检测模式，调整探头获取清晰的右心室图像，将图像向鼠头侧缓慢移动获得主动脉弓图像，可同时观察到无名动脉、左侧颈总动脉、左侧锁骨下动脉、主动脉弓缩窄部位，保存图像。

1.4 显微CT扫描及3D打印 C57BL／6小鼠经异氟烷麻醉后作胸部正中切口分离皮肤及皮下筋膜，于肋骨剑突穿透横膈膜进入胸腔，暴露心脏，1 ml注射器抽取碘普罗胺造影剂，沿心尖部穿刺进入左心室，保持注射器位置，缓慢推动注射器将造影剂注入左心室，造影剂推注约1 ml后停止灌注，使用小动物Inve⁃on Micro CT进行胸前区扫描，采集CT血管造影图像（CT angiography，CTA）数据。

将CTA原始数据转换为DICOM格式后导入Materialise Mimics 21.0软件，选择收缩末期影像，利用Threshold调节阈值，选择主动脉区域，构建蒙版（mask），结合Region Grow、Split Mask、Edit Masks等功能提取出主动脉蒙版，构建主动脉三维模型，并以STL格式导入3－Matic软件，获得可用于3D打印的立体光刻（stereo lithography，STL）格式文件。采用Form2打印机（美国Stratasys公司）和透明树脂材料Clear V4完成主动脉3D模型打印。

1.5 心肌组织HE染色和Masson染色 2组小鼠饲养28 d后，将各组小鼠心脏取出，用预冷的PBS将心脏内残余血液冲洗干净，将各组小鼠心脏分别放入盛有40 g／L多聚甲醛的EP管中固定48 h，行常规的石蜡包埋、切片，并分别进行HE和Masson染色。光镜下（×400）观察心肌组织变化。每张HE切片随机读取不少于10个视野，每个视野选取10个心肌细胞横截面（截面呈近似圆形），应用Case⁃Viewer软件分别测量截面面积（2μm）并记录。

1.6 小鼠心脏重量（heart weight，HW）、体重（body weight，BW）、胫骨长度（tibial length，TL）测量 将各组小鼠经异氟烷麻醉后，放置于已调零的电子天平上称取并记录BW，将小鼠仰卧位固定于小动物解剖台，颈部皮肤正中做1 cm左右切口，逐层剥离皮下组织，分离一侧颈总／内动脉，用眼科剪离断一颈总／内动脉放血，完毕后，以组织剪剪开胸骨，剥离心脏周围组织及主动脉，游离出心脏，在主动脉根部离断，将心脏放入预冷的PBS溶液中，清洗血细胞后将心脏放到滤纸上吸干表面溶液后称重。将小鼠右后肢皮肤纵行切开，逐层分离皮下组织、肌肉组织，将胫骨游离出，进一步剔除胫骨表面附着的肌肉组织，用游标卡尺测量胫骨长度。记录每只小鼠BW、HW及TL，计算HW／BW，HW／TL。

1.7 Western blot检测 提取各组小鼠心肌组织蛋白β－主要组织相容性复合体（major histocompati⁃bility complex，β－MHC）、心房利钠肽（atrial natri⁃uretic peptide，ANP）和脑钠肽（brain natriuretic pep⁃tide，BNP），提取方法、分离、封闭等具体操作参考文献9［9］，孵育抗β－MHC（1∶1 000稀释）、抗ANP（1∶1 000稀释）、抗BNP（1∶1 000稀释）和抗磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）（1∶1 000稀释）抗体，4℃条件下12 h；用TBST溶液洗涤3次；室温孵育对应的二抗（1∶5 000稀释）1.5 h；用TBST洗涤3次。使用Bio－Rad成像系统检测蛋白质条带，内参选择GAPDH，使用Image Lab软件定量分析。

1.8 统计分析 采用SPSS 20.0进行统计学分析，Graph Pad Prism 5软件进行作图。计数资料以均数±标准差（±s）表示，组间数据比较采用配对样本t检验方法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

TAC组10只小鼠全部存活4周，超声测量结果见表1。TAC组小鼠左室射血分数（31.15±12.56）%、左室短轴缩短率（12.95±6.52）%、收缩期左室内容积（20.46±2.99）μl、舒张期左室内容积（66.64±8.30）μl明显低于Sham组（P＜0.01）。

超声二维图像显示其主动脉缩窄（图1），3D打印重建模型从不同角度清晰显示主动脉缩窄部位（图2）。

与Sham组相比，TAC组心肌横截面积明显增大（P＜0.05）（图3）。Sham组HW／BW比值、HW／TL长度比值明显低于TAC组（P＜0.05）（图4）。

图1 TAC组小鼠主动脉缩窄超声影像

图2 主动脉缩窄C57小鼠CT重建影像及3D打印模型

图3 两组小鼠心脏HE染色结果（×400）

表1 两组小鼠超声测量结果（n＝10，±s）

表1 两组小鼠超声测量结果（n＝10，±s）

注：LVEF：左室射血分数；FS：左室缩短率；LVEDV：左室舒张末期容积；LVESV：左室收缩末期容积。

?

图4 两组小鼠HW分别与BW和TL的比较

图5 两组小鼠心肌组织Western blot检测

3 讨 论

一直以来对肥厚型心肌病的基础机制的探索不断推陈出新，而最近在其临床治疗方法方面也有了革新性的突破——超声引导下经皮心肌内室间隔射频消融术（percutaneous intramyocardialseptal radiofre⁃quency ablation，PIMSRA）——Liwen术式的一种［10］。成人主动脉弓缩窄也由体外循环下开胸手术发展为可选择更加微创的治疗方式——经皮覆膜支架植入术（percutaneous covered stent implantation，PCSI）［11］。Liwen术式、PCSI等介入手术是借助影像技术在非直视状态下进行的，有赖于影像学技术的进步以及术者对解剖结构的充分认知，而在基础科研实验中也需要对心肌肥厚、TAC进行影像学的评价。本文旨在探索应用3D打印技术对TAC小鼠缩窄部位的模型重建，验证3D打印模型用于评价TAC模型的可行性以及有效性。

利用计算机断层扫描、超声、磁共振影像学数据结合Mimics、3Mensio等工程软件进行体外数据重建，将数据输入3D打印机中可以打印出不同材质的结构模型，在体外进行观察以及操作。3D打印技术经历了20余年的发展，目前已在口腔科学、骨科、整形外科神经外科等多个学科领域得到了广泛的应用，包括植入物和设计、手术规划、医学科研、教育及培训［12－17］。

本研究通过TAC方法建立动物模型，HE、Mas⁃son组织学染色结果提示TAC组小鼠心肌细胞横截面积增大、心肌纤维化，同时，Sham组HW／BW、HW／TL明显低于TAC组，而TAC组小鼠心肌组织中肥厚相关蛋白β－MHC、ANP、BNP相对表达量明显增高，证实了TAC组小鼠出现心肌肥厚。影像学检查4周超声结果在二维影像上提示结扎部位存在狭窄，同时心功能下降、左室容积减小。同样地，CTA影像数据重建可以直观观察到狭窄部位，在体外从三维形态上观察TAC组小鼠TAC部位解剖结构，证实了3D打印模型的体外模拟作用。

3D打印技术在医学心血管中的应用相对较晚，应用范围也存在限制。然而，根据《中国心血管病报告2017》指出，心血管病死亡占居民疾病死亡原因构成比的40%以上，居首位，高于肿瘤及其他疾病。总体上，中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。推算心血管病患人数2.9亿，其中脑卒中1 300万，冠心病1 100万，肺原性心脏病500万，心力衰竭450万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，高血压2.7亿。巨大的患者群体及市场应用前景也促进了3D打印技术在心血管领域的不断拓展，目前3D打印技术在心血管疾病中的应用从帮助临床诊断到指导手术治疗、增进医患沟通、模拟手术、体外及动物实验高级心血管研究等［18－21］。本研究通过在小鼠TAC模型上进行3D打印模型的建立，旨在阐明3D打印技术在动物实验中的影像学评价作用，为大动物模型甚至人体主动脉弓缩窄疾病的影像学评价及体外模拟提供实验基础。

综上所述，在小鼠TAC模型影像学评价中，3D打印技术的应用具有可行性。未来，3D打印技术在其他结构性心脏病中还有进一步应用和拓展的空间，同时，随着材料学、生物工程、组织工程等学科领域的不断发展与融合，促使3D生物打印技术的不断进步，相信3D打印将很快应用于临床心血管生物产品的制作。