双酶法提取大蒜多糖工艺优化及其体外抗氧化活性研究

董玉玮，苗敬芝*，李勇

(1.徐州工程学院 食品与生物工程学院，江苏 徐州 221018；2.江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室，江苏 徐州 221018)

大蒜为多年生草本、百合科葱属植物，在我国种植广泛[1]。大蒜中含有多种生物活性物质，主要有多糖、氨基酸、维生素、微量元素等，因而对人体具有抗氧化、防衰老、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力等多种生理功能[2,3]。大蒜多糖是其主要的活性成分之一，能增强T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨细胞的活力，具有保护肝脏、抗菌消炎、降血糖、降血脂、防止动脉粥样硬化、调节机体免疫力等功效，在保健食品和医药领域有着广阔的开发前景[4,5]。

大蒜多糖常用的提取方法有热水提取法、微波提取法、超声波提取法、酸碱提取法等[6-9]。本试验以大蒜为原料，采用双酶法提取大蒜多糖，利用酶具有较高的选择性，能高效温和地促使细胞壁裂解，促进多糖向溶液中浸出，所得产物性质稳定，活性高等特点[10,11]，通过单因素试验和响应曲面法优化大蒜多糖的提取工艺条件，探讨大蒜多糖的体外抗氧化活性，并与VC对照，为大蒜产品的深加工提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大蒜：徐州市大韩农贸市场。

浓硫酸、苯酚、硫酸亚铁、水杨酸、DPPH、邻苯三酚、95%乙醇等均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

SENCO旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；DHG-9075电热鼓风干燥箱 上海慧泰仪器制造有限公司；723G可见分光光度计 上海分析仪器有限公司；TDL-6低速大容量离心机 金坛晨阳电子仪器厂；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 双酶法提取大蒜多糖工艺流程

大蒜→去皮、清洗→切片→干燥→粉碎、过筛→称取一定量大蒜粉→加入纤维素酶和果胶酶→按一定料液比加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节pH→酶解→灭酶→离心→上清液→苯酚-硫酸法测多糖含量。

1.3.2 单因素试验

1.3.2.1 纤维素酶添加量对大蒜多糖得率的影响

酶解温度50 ℃，料液比1∶25，果胶酶2.0%，探讨纤维素酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)对大蒜多糖得率的影响。

1.3.2.2 果胶酶添加量对大蒜多糖得率的影响

酶解温度50 ℃，料液比1∶25，纤维素酶2.0%，探讨果胶酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)对大蒜多糖得率的影响。

1.3.2.3 酶解时间对大蒜多糖得率的影响

酶解温度50 ℃，料液比1∶25，纤维素酶2.0%，果胶酶2.0%，探讨酶解时间(120，140，160，180，200 min)对多糖得率的影响。

1.3.2.4 酶解温度对大蒜多糖得率的影响

料液比1∶25，纤维素酶添加量2.0%，果胶酶添加量2.0%，探讨酶解温度(35，40，45，50，55 ℃)对多糖得率的影响。

1.3.3 响应曲面法优化试验设计

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理[12,13]，采用四因素三水平的响应曲面分析法，试验因素水平设计见表1。

表1 响应曲面因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface

1.3.4 大蒜粗多糖的制备

按优化方案提取大蒜多糖，离心分离，上清液用旋转蒸发仪蒸发浓缩至原体积的1/3，按体积比4∶1加入95%乙醇纯沉，经4000 r/min离心20 min，真空冷冻干燥28 h，得大蒜粗多糖。

1.3.5 大蒜多糖体外抗氧化活性试验

1.3.5.1 大蒜多糖对O2-·自由基清除率的测定[14]

分别取浓度为0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次加入3.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)于试管中，置于25 ℃水浴预热20 min，加入2 mL 2.5 mmol/L邻苯三酚溶液，充分混匀，25 ℃反应5 min，加入2 mL 8%的盐酸溶液终止反应。以蒸馏水作空白试验，以相同质量浓度的VC溶液作对比，在325 nm处测定吸光度。根据式(1)计算不同浓度的多糖溶液对O2-·的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(1)

式中：A1为样品的吸光度值，A2为对照的吸光度值，A0为空白品的吸光度值。

1.3.5.2 大蒜多糖对 ·OH自由基清除率的测定

分别取浓度为0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次向试管中加入1 mL Fe2+(9 mmol/L)、1 mL 水杨酸-乙醇(9 mmol/L)、1 mL H2O2(8.8 mmol/L)，在510 nm波长处测吸光度，以1 mL蒸馏水作空白，以相同质量浓度的VC溶液作对比。根据式(2)计算不同浓度的多糖溶液对·OH的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(2)

式中：A1为样品的吸光度值，A2为对照的吸光度值，A0为空白品的吸光度值。

1.3.5.3 大蒜多糖对DPPH自由基清除率的测定[15]

分别取浓度为0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次加入个加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液中，25 ℃反应25 min后，在517 nm处测定吸光度。以蒸馏水作空白，以相同质量浓度的VC溶液作对比，根据式(3)计算不同浓度的样品溶液对DPPH的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(3)

式中：A1为样品的吸光度值，A2为对照的吸光度值，A0为空白品的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验条件选择

2.1.1 纤维素酶添加量对大蒜多糖得率的影响

图1 纤维素酶添加量对大蒜多糖得率的影响Fig.1 Effect of cellulase additive amount on the yield of garlic polysaccharides

由图1可知，纤维素酶添加量在0.5%～2.0%之间，大蒜多糖得率逐渐上升，在该范围内酶添加量越多，酶解效率越高，大蒜多糖越易从裂解细胞中溶出。添加量为2.0%时，多糖得率最高，为28.96%；酶量增至2.5%时，多糖得率下降，可能是酶浓度较高，底物浓度相对较小，酶分子过饱和，部分酶分子不能与底物结合，降低了酶解效率。因此，纤维素酶最佳添加量为2.0%。

2.1.2 果胶酶添加量对大蒜多糖得率的影响

图2 果胶酶添加量对大蒜多糖得率的影响Fig.2 Effect of pectinase additive amount on the yield of garlic polysaccharides

由图2可知，果胶酶添加量在0.5%～2.0%之间，大蒜多糖得率逐渐增加；果胶酶添加量为2.0%时，大蒜多糖得率最高，为28.84%，这时可能酶和底物浓度最适合，酶解效率最高，有利于多糖的溶出。因此，果胶酶最适添加量为2.0%。

2.1.3 酶解时间对大蒜多糖得率的影响

图3 酶解时间对大蒜多糖得率的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of garlic polysaccharides

由图3可知，随着酶解时间的增加，大蒜多糖得率呈现先增后降的趋势，160 min时多糖得率最高，为32.47%，随后下降，可能是随着时间的延长，多糖结构发生变化而降解。因此，最适宜的酶解时间为160 min。

2.1.4 酶解温度对大蒜多糖得率的影响

图4 酶解温度对大蒜多糖得率的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of garlic polysaccharides

由图4可知，温度在35～50 ℃之间，大蒜多糖得率逐渐上升，在适宜的温度范围内，升高温度，酶解效率提高，促进多糖从裂解的细胞中溶出，50 ℃时多糖得率最高，为30.47%，随后下降，温度过高，酶的活性受到抑制而失活。因此，最适宜的酶解温度为50 ℃。

2.2 响应曲面法优化大蒜多糖的提取工艺

2.2.1 模型的建立与显著性检验

采用Box-Behnken试验，以纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度为变量，以大蒜多糖得率为响应值，以-1，0，1分别代表变量的水平，试验设计与结果见表2。

表2 响应曲面试验设计及结果Table 2 Results of response surface test design

续 表

用Design-Expert 8.0软件对表2中的数据进行多元回归分析，得到大蒜多糖得率对纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度的回归模型：

Y=34.81+0.012X1-0.068X2-0.34X3+0.042X4+1.44X1X3+0.093X1X4-0.098X2X3-0.42X2X4-0.29X3X4-2.24X12-2.30X22-2.61X32-1.41X42。

方差分析结果见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

续 表3

由表3方差分析结果可知，模型P<0.01，试验模型极显著，失拟项P=0.9731>0.05，失拟项不显著；模型的决定系数R2=0.9925，校正决定系数RAdj2=0.9746，二者数值较为接近，表明该回归方程拟合程度良好，用该模型分析和预测大蒜多糖的得率是可靠的。模型F值与对响应值的影响成正比，F值越大，对响应值的影响越大[16]，可见4个因素对大蒜多糖得率的影响大小依次为：酶解时间>纤维素酶添加量>酶解温度>果胶酶添加量。

2.2.2 响应曲面交互作用分析

a.果胶酶添加量与纤维素酶添加量交互作用对大蒜多糖得率影响的等高线图和响应曲面图

b.果胶酶添加量与酶解温度交互作用对大蒜多糖得率影响的等高线图和响应曲面图

c.果胶酶添加量与酶解时间交互作用对大蒜多糖得率影响的等高线图和响应曲面图

d.纤维素酶添加量与酶解温度交互作用对大蒜多糖得率影响的等高线图和响应曲面图

f.酶解时间与酶解温度交互作用对大蒜多糖得率影响的等高线图和响应曲面图图5 因素交互作用对大蒜多糖得率影响的等高线图和响应曲面图Fig.5 Contour plots and response surface plots of the effect of factor interaction on the yield of garlic polysaccharides

由响应曲面图可知，图5中b，d，e接近椭圆形，故果胶酶添加量与温度、纤维素酶添加量与温度、纤维素酶添加量与时间的交互作用对大蒜多糖得率的影响较为显著；图5中a，c，f接近圆形，故果胶酶与纤维素酶添加量、果胶酶添加量与时间、酶解时间与温度的交互作用对大蒜多糖得率的影响不显著。

2.2.3 条件优化与结果验证

根据建立回归模型对提取工艺进行优化，得到最佳提取工艺：纤维素酶添加量1.99%，果胶酶添加量1.96%，温度49.65 ℃，时间160.48 min，在此提取条件下大蒜多糖的得率理论值为34.88%。考虑到实际操作过程中的局限性，将提取工艺修改为：纤维素酶2.0%，果胶酶2.0%，温度50 ℃，时间160 min。采用修正后的条件进行试验，重复3次取平均值，大蒜多糖实际测定得率为34.76%，与预测值相差0.12%，验证试验结果表明实测值与预测值存在较好的一致性。由此表明该回归方程有很好的预测能力，可用于大蒜多糖的提取。

2.3 大蒜多糖体外抗氧化活性试验结果

2.3.1 大蒜多糖对O2-·自由基的清除能力

图6 大蒜多糖对O2-·自由基的清除能力Fig.6 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to O2-·

由图6可知，随着大蒜多糖浓度的增加，对O2-·自由基的清除能力增大。当大蒜多糖浓度为0.6 mg/mL时，清除率为47.79%，VC清除率为79.65%，之后清除率变化缓慢。在相同质量浓度下，VC对O2-·的清除率高于大蒜多糖。

2.3.2 大蒜多糖对·OH自由基的清除能力

图7 大蒜多糖对·OH的清除能力Fig.7 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to·OH

由图7可知，随着大蒜多糖浓度的增加，对·OH自由基的清除能力增大。当大蒜多糖浓度0.7 mg/mL时，清除率为49.84%，VC清除率为89.16%，之后清除率变化缓慢。在相同质量浓度下，VC对·OH的清除率高于大蒜多糖。

2.3.3 大蒜多糖对DPPH自由基的清除能力

图8 大蒜多糖对于DPPH·的清除能力Fig.8 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to DPPH·

由图8可知，随着大蒜多糖浓度的增加，对DPPH自由基的清除能力随之增大。当大蒜浓度为0.7 mg/mL时，大蒜多糖的清除率为56.74%，VC清除率为82.76%，之后清除率变化缓慢。

3 结论

在单因素试验的基础上，对大蒜多糖提取工艺条件进行四因素三水平响应曲面法设计，建立了大蒜多糖得率和各因素之间的数学模型，通过对回归模型系数的显著性分析，得到各因素之间的相互作用，影响大蒜多糖得率的因素大小顺序为：酶解时间>纤维素酶添加量>酶解温度>果胶酶添加量。大蒜多糖最佳提取工艺参数为：纤维素酶2.0%，果胶酶2.0%，温度50 ℃，时间160 min，大蒜多糖实际测定得率为34.76%，与预测值相差0.12%，存在较好的一致性。

大蒜多糖对O2-·、·OH和DPPH自由基均表现出较强的清除能力，且随其浓度的增加，清除能力增大，呈明显的量效关系，相同质量浓度大蒜多糖的清除效果低于Vc，但大蒜多糖作为活性成分来源于天然产物。因此，采用双酶法提取的大蒜多糖具有良好的抗氧化活性，可作为天然绿色的抗氧化剂添加到食品中，具有广阔的市场前景。