食醋酿造中酯类生成及酯化酶的应用研究

秦伟军，王建云

(1.北京大陆航星质量认证中心股份有限公司，北京 100089；2.山西梁汾金龙鱼醋业有限公司，山西 晋中 030622)

食醋是人们日常饮食中非常重要的酸性调味品。食醋要想引起人们的食欲与达到食物调味的目的，必须具有良好的感官特性，包括色泽、香气、滋味、体态[1]。其中影响食醋风味的成分包括挥发性成分、不挥发性成分。不挥发性成分影响食醋的滋味，即人的味觉评价；挥发性成分影响食醋的香气，即人的嗅觉评价[2]。香气对评价食醋风味品质起着至关重要的作用。

食醋香气主要呈现果香、坚果香、焦香及烘烤香、花香、酸香的复合香气。影响食醋香气的物质主要包括酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、杂环类[3-5]。食醋中的酯类物质是醋香的主要构成物质，是形成食醋特有香气的重要成分，在食醋发酵酿造和后熟的过程中霉菌、酵母菌、细菌等微生物在酯化酶的作用下，将发酵中产生的有机酸和醇类物质通过酯化反应形成酯类物质，其通常具有果香或花香气味[6,7]。

在白酒生产过程中，酶化酶的使用可有效缩短发酵时间，提高白酒的出酒率和提取率，提高白酒的品质[8]。国内外文献报道可以使用超声波、超高压、微波、高压静电场、红外等方法对酒类、醋类进行催陈，食醋的色、香、味有所提高[9,10]，但由于各种原因，实际应用较少，生物酶法加速醋的陈化是新的研究方向。陈酿过程中的主要化学反应包括：酸与醇的酯化反应、醇醛缩合反应、氧化反应、极性分子之间的缔合、美拉德反应等，其中酯化反应是其陈酿过程中的重要反应[11]。在固态食醋酿造工艺中添加含有一定量酯化酶的制剂，酯香有明显提高[12]。固定化酯化酶处理的山西老陈醋醋液中总酯含量比原醋液提高28.1%，感官评定基本达到自然陈酿3个月醋液的口感，具有食醋催陈的作用[13,14]，是比较先进的新工艺。但研究食醋酿造过程中各阶段总酯生成变化和酯化酶在醋酸发酵中的应用研究资料较少。

本文通过探究酯类在酒精发酵和醋酸发酵阶段的生成变化，确定食醋酯类生成的主要阶段，然后对酯化酶在食醋醋酸发酵过程中进行优化应用研究，探究酯化酶对食醋酯类和品质的影响，尤其是对食醋口感和香气的影响，为香醋的开发和应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

膨化高粱；大曲；麸皮；谷糠；酯化酶(食品级，100000 U/g)：武汉佳成生物制品有限公司；酒醪；酒醅；醋醅；醋液；无水乙醇。

1.2 仪器与设备

pHSJ-3F型pH计 上海精密科学仪器有限公司；水浴锅；BSA124S型电子天平 赛多利斯公司；HP5890型气相色谱仪。

1.3 方法

1.3.1 酒精发酵实验

对调好的配料醪液进行酒精发酵，其中前3 d敞口发酵，后15 d密闭发酵。配料比例中膨化高粱、大曲、水的比例为100∶62.5∶500。对大缸中发酵的酒醪1～18 d每天进行取样，检测总糖、总酯、总酸、不挥发酸、香气成分，并对酒醪进行感官分析，包括分层情况、上清液的颜色、酒醪的香气、固形物比例，考察酯类的变化。

1.3.2 醋酸发酵实验

在酒醅中接入2/3量的固态火醅(菌种)进行醋酸发酵，并按照固态发酵的方式每天进行翻醅发酵。在酒醅加入不同比例的酯化酶液进行搅拌混匀和醋酸发酵。每天对醋醅进行取样，检测总酯、总酸含量。

1.3.3 陈酿实验

对醋醅进行淋醋和灭菌，得到灭菌醋。在灭菌醋中加入不同比例的酯化酶液封口陈酿不同时间，考察酯类的变化。每天对醋醅进行取样，检测总酯、总酸含量。

1.3.4 测定方法

总糖、总酯、总酸、不挥发酸的检测方法详见GB/T 19777-2013《地理标志产品 山西老陈醋》[15]。

1.4 酯化率计算

式中：A1为添加酯化酶的醋醅总酯含量；A2为未添加酯化酶的醋醅总酯含量。

2 结果与分析

2.1 食醋酿造过程中指标变化分析

2.1.1 酒精发酵过程中指标变化

在酒精发酵过程中酒精度、酸度、酯类变化见图1和图2。

图1 酒精发酵过程中酒精度含量变化Fig.1 The changes in alcohol content during alcohol fermentation process

由图1可知，酒精度在0～8 d呈逐步上升的趋势：0～2 d增长幅度最大，为5.5%；2～8 d变化范围为5.5%～7.8%，变化仅为2.3%；8～18 d变化很小，略有下降，从7.9%下降到7.4%。

图2 酒精发酵过程中酸类与酯类含量变化Fig.2 The changes in content of acids and esters during alcohol fermentation process

由图2可知，总酸含量在0～18 d总体变化很小；发酵8～18 d略有增长趋势。总酯含量在0～1 d上升最快，为1.58 g/dL，这与在大曲中存在酯化酶和酯化菌有关。随后1～8 d呈现略微下降趋势；8～18 d呈现略微上升趋势，由0.8 g/dL上升至1.28 g/dL。

8～18 d酒精度呈现略微下降趋势，总酸和总酯含量呈现略微增长趋势，说明存在醇类与酸类的酯化反应，并存在部分乙醇转化为酸的变化过程。由于大曲中所含酯酶的菌系和酯酶较多，具体生成机理不是非常明确，其原因还有待进一步分析研究。

2.1.2 醋酸发酵过程中总酸、总酯含量变化

在醋酸发酵过程中总酸、总酯的变化见图3和图4。添加酯化酶进行醋酸发酵总酸几乎没有变化，影响可以忽略。

图3 醋酸发酵过程中总酸含量变化Fig.3 The changes in total acids' content during acetic acid fermentation process

图4 醋酸发酵过程中总酯含量变化Fig.4 The changes in total esters' content during acetic acid fermentation process

由图3和图4可知，醋酸发酵总酯的生成量主要在前4 d，平均每天的生成量为0.21 g/dL。第5，6天醋酸发酵为结束期，产酸分别为3.94，3.90 g/dL(新酒醅的总酯含量为0.71 g/dL)。酯类的生成量随着醋酸发酵时间的延长而增加，当醋酸发酵接近结束时，酯类的生成量也趋于稳定。具体生成机理未见相关文献报道，其原因还有待进一步分析研究。

2.1.3 陈酿过程中总酯变化

对食醋进行密封陈酿，1，2，3个月分别取样查看总酯和总酸变化。1～3个月总酯变化略有上升，约上升0.40 g/dL；3～4个月总酯变化趋于稳定。总酸在0～4个月略有下降，约下降0.12 g/dL。

表1 总酯和总酸随陈酿时间的变化Table 1 The changes in content of total acids and totalesters during aging process

通过以上分析，在酒精发酵、醋酸发酵、陈酿过程中，都伴随着总酯的变化。其中醋酸发酵过程是总酯生成的主要阶段，总酯生成时间比酒精发酵和醋酸发酵所用时间短，生成总酯量最多。

2.2 酯化酶在食醋酿造中的应用

在食醋酿造环节中添加酯化酶，提高总酯生成量，缩短食醋催陈时间，提高食醋酯香味和品质。

2.3 酯化酶对醋酸发酵过程中总酯的影响

在醋酸发酵过程中总酸变化见图5。添加酯化酶进行醋酸发酵总酸几乎没有变化，影响可以忽略。在醋醅中添加酯化酶与不添加酯化酶进行醋酸发酵的总酯含量对比见图6。

图5 醋酸发酵过程中总酸含量变化Fig.5 The changes in total acids' content during acetic acid fermentation process

图6 醋酸发酵过程中总酯含量变化Fig.6 The changes in total esters' content during acetic acid fermentation process

由图6可知，随着醋酸发酵时间的延长，总酯呈现增加趋势。其中加入酯化酶的醋醅总酯生成量在2 d时最大，增加1.58 g/dL，2～6 d增加很小，仅为0.18 g/dL。未加酯化酶的醋醅，总酯生成量逐步增加，1～4 d生成量比较均衡。总的来看，加酯化酶的醋醅生成总酯量要多于未加酯化酶的总酯总量，醋酸发酵第6天结束，加酯化酶的醋醅、未加酯化酶的醋醅，总酯生成量分别为3.64，2.47 g/dL，加酶的醋醅所生成总酯比未加酶总酯含量高1.17 g/dL，说明醋酸发酵期间加酯化酶酯化反应是有效的。发酵6 d结束，酯化率提高了47.3%。

2.4 酯化酶对陈酿过程中总酯生成的影响

对食醋进行常温密封陈酿，添加酯化酶的食醋，总酯和总酸变化见表2。

表2 总酯和总酸随陈酿时间的变化Table 2 The changes in content of total esters and total acids during aging process

总酸在0～12 d略有下降，下降约0.12 g/dL。1，2，3个月分别取样查看总酯和总酸变化。经过优化，添加0.2% 的酯化酶为足量的，随着陈酿时间的延长，总酯含量逐步增加，在第9天时总酯变化趋于稳定。经过感官品评，未陈酿的加酯化酶的醋酸发酵灭菌醋要好于未加酯化酶陈酿3个月的灭菌醋。加酯化酶来提高食醋的总酯含量，对食醋有催陈作用，食醋更有醇厚感,这与王冕等、张媛渊等研究得出的结论较为一致。

3 结论

在食醋酿造的整个过程中，跟踪分析香气中总酯生成变化。在酒精发酵、醋酸发酵、陈酿过程中均对香气总酯的生成有贡献，但醋酸发酵的总酯生成量最大。

在醋酸发酵、陈酿过程中加酯化酶，分析研究酯化酶对总酯生成的影响。酯化酶可促进总酯的生成，醋酸发酵总酯的促进生成主要在0～2 d。醋酸发酵第6天结束，加酯化酶的醋醅、未加酯化酶的醋醅，总酯生成量分别为3.64，2.47 g/dL，加酶的醋醅所生成总酯比未加酶总酯含量高1.17 g/dL，说明醋酸发酵期间加酯化酶酯化反应是有效的。发酵6 d结束，酯化率提高了47.3%。酯化反应对总酸的变化影响较小。加酯化酶陈酿9 d的食醋与未加酯化酶陈酿3个月的食醋，酯类增加量相当，约0.4 g/dL，酯类香气浓郁，食醋醇厚感增强，酯化酶对食醋催陈品质提高具有很好的作用。