植物乳杆菌PMO的安全性分析

王春幸，OH YOUNG JOO，甘奕，KIM TAE SUK，李洪军，IK HYUN YEO，贺稚非*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(韩国圃美多有限责任公司，首尔，120-749)

益生菌作为对人体有益的活性微生物，对健康的调节作用获得全球共识，驱动着益生菌行业的快速发展。其中植物乳杆菌具有良好的生理特性和益生功能，成为研究的热点[1]。大量的研究证实，植物乳杆菌具有抗氧化[2]、调节血脂[3]、降胆固醇[4]、抑制致病菌[5]等益生功效。最新研究表明植物乳杆菌可以改变小鼠体内氧化应激和脑参数水平，从而改善学习和记忆障碍[6]。因此植物乳杆菌可用于预防或治疗某些过敏性疾病[7]，作为神经和心理疾病的潜在疗法[8]，应用发展潜力巨大。

益生菌产品主要是通过调节机体代谢，增强免疫功能，在全球范围内发展迅速，因此必须重视益生菌的安全性问题[9]。益生菌普遍被认为是安全的，但某些益生菌能使免疫系统不健全或者胃肠道功能障碍引起某些不良反应[10]。益生菌能在胃肠道内存活和增殖，并具有较强的内转移能力[11]，因此开发出新的益生菌菌株在使用前必须要进行安全性评价。本研究以从韩国泡菜中分离筛选得到的新型植物乳杆菌PMO(LactobacillusplantarumPMO)为评价对象，对所选菌株的抗生素敏感性、细菌易位、脏器指数和生化指标等进行分析，旨在为开发新型功能性益生菌产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 实验菌株

L.plantarumPMO，韩国圃美多有限责任公司。接种于MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，待用。

1.1.2 实验动物

昆明小鼠：清洁级，6周龄，(20±2)g，雌雄各20只，购于藤鑫生物技术有限公司。基础饲料购于重庆市中药研究所实验动物中心。小鼠在适应期(7 d)内可以自由饮水、采食。实验前16 h禁食，但可自由饮水。饲养温度为(20±2)℃，相对湿度60%。

1.1.3 主要试剂

MRS培养基、沙门氏菌-志贺氏菌(Salmonella-Shigella，SS)培养基，杭州天和微生物试剂有限公司；蛋白定量试剂盒、谷草转氨酶(glutamate oxaloacetate transaminase，GOT)试剂盒、谷丙转氨酶(glutamate pyruvic transaminase，GPT)试剂盒、总胆红素(total bilirubin，TBIL)试剂盒、血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)试剂，南京建成生物技术公司。

1.1.4 实验设备

高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；XHF-D高速匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；SS-325型高压灭菌锅，日本Tony公司；UV-2450紫外分光光度计，日本岛津公司；SYNERGY HIMG酶标仪，美国Bio Tek。

1.2 实验方法

1.2.1 OD值与活菌数标准曲线的绘制

将培养24 h的L.plantarumPMO稀释摇匀，于波长600 nm处测定其OD值，以MRS液体培养基作空白对照进行调零。分别选取OD值为0.10、0.20、0.30、0.45、0.60、0.70的稀释液测定活菌数，绘制标准曲线(如图1所示)。

图1 L. plantarum PMO OD值与活菌数标准曲线Fig.1 Standard curve of L. plantarum OD value and viable count

结果显示,600 nm处的吸光度值在0.10～0.70范围内，与活菌数具有良好的线性关系：y=1.568 3x+7.814，R2=0.989 4。

1.2.2 抗生素敏感性

L.plantarumPMO的抗生素敏感试验以药敏纸片琼脂扩散法进行测定[12]。取100 μL活化24 h的菌液涂布于MRS固体培养基；培养基将菌液完全吸收后，将氟哌酸、头孢拉定、庆大霉素、四环素、氯霉素、红霉素药敏纸片置于涂布菌液的培养基上；37 ℃培养24 h，测量各药敏纸片的抑菌圈直径(mm)。抗生素敏感性结果根据《CLSI抗菌药物敏感性试验标准》判定。

1.2.3 急性毒性

根据GB 15193.3—2014中寇氏法[13]评价L.plantarumPMO对小鼠的经口急性毒性。小鼠随机分为4组(每组10只、雌(♂)雄(♀)各半)。活化后的L.plantarumPMO以接种量1%(体积分数)接种于MRS液体培养基，37 ℃培养18 h后4 ℃，5 000 r/min离心10 min，以无菌生理盐水洗涤2次；以最大菌体浓度的十倍浓缩浓度作为高剂量组(5×1011CFU/mL，HL)、十倍稀释浓度为中剂量组(5×109CFU/mL，ML)、千倍稀释浓度为低剂量组(5×107CFU/mL，LL)；灌胃体积为20 mL/[kg(bw)·d]，连续灌胃21 d，对照组(ND)小鼠以同等体积的生理盐水替代。

1.2.4 一般体征观察

每日记录小鼠的采食量与体质量变化，并观察摄食、饮水、活动状况及死亡情况。

1.2.5 细菌易位

对小鼠进行灌胃24 h后，麻醉小鼠，无菌心脏穿刺获得小鼠血液样本。随后解剖小鼠，以无菌棉签擦拭脏器表面，涂布于MRS和SS固体培养基，37 ℃培养48 h；无菌摘取肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏，分别取1 g加无菌生理盐水均质；取0.1 mL血液、脏器匀浆上清液，分别涂布于MRS和SS固体培养基，37 ℃培养48 h。培养基中有菌落生长即为阳性，表示细菌易位，并按公式(1)计算细菌易位发生率:

(1)

1.2.6 脏器指数

小鼠在末次灌胃24 h后称量体质量，脱臼处死，摘取心脏、肝脏、脾脏和肾脏。用生理盐水冲洗脏器，滤纸吸干表面水分后称重，按公式(2)计算脏器指数:

(2)

1.2.7 生化指标

小鼠末次灌胃24 h后使用乙醚麻醉，摘除眼球采血。待测血清样品的制备：血样于37 ℃静置1 h、4 ℃放置3 h后，在4 ℃ 条件下3 000 r/min离心10 min制得血清，-20 ℃保存备用。待测肝脏组织样品的处理：取肝脏组织按质量加入9倍的生理盐水，在冰水条件下机械匀浆、制成质量分数10%的组织匀浆，在4 ℃ 条件下3 000 r/min离心10 min，取上清液于-20 ℃保存、备用。测定前根据预实验结果取一定量上清液用生理盐水稀释成质量分数1%的待测组织上清液,同时采用蛋白定量试剂盒测定上清液蛋白质量浓度。

采用比色法测定小鼠肝脏和血清中的GOT、GPT的酶活力以及小鼠血清中TBIL、BUN含量，血清中的生化指标可直接取样进行测定，肝脏组织的生化指标需经过处理后再按相同的方法进行测定。

1.2.7.1 肝脏和血清中GOT酶活力的测定

测定管：分别添加0.1 mL样品和0.5 mL基液，于37 ℃水浴加热30 min后加入0.5 mL 2,4-二甲基苯肼溶液，同样于37 ℃水浴加热20 min，最后加入5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液混匀，室温放置5 min，以双蒸水调零后于505 nm处测定OD测定管。

对照管：添加0.5 mL基液，于37 ℃水浴加热30 min后加入0.5 mL 2,4-二甲基苯肼溶液和0.1 mL样品，同样于37 ℃水浴加热20 min，最后加入和5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液混匀，室温放置5 min，以双蒸水调零后于505 nm处测定OD对照管。

绝对OD值=OD测定管-OD对照管，根据绝对OD值查标准曲线(y=a+bx+cx1.5+dx3；a=0.000 600 822 1，b=0.004 833 559 5，c=0.000 245 779 51，d=9.741 058 2E-09)，得到血清中GOT酶活力(U/L)。

按公式(3)计算肝脏中GOT酶活力(U/g)：

(3)

1.2.7.2 肝脏和血清中GPT酶活力的测定

测定管和对照管的试剂添加以及测定方法同1.2.7.1小节，根据绝对OD值查标准曲线(y=a+bx+cx1.5+dx2+ex3；a=-5.587 264 8E-05，b=0.003 129 920 9，c=0.000 210 366 26，d=2.854 875 5E-05，e=4.450 846 3E-08)，得到血清中GPT酶活力(U/L)。按公式(4)计算肝脏中GPT酶活力(U/g)：

(4)

1.2.7.3 血清中TBIL含量的测定

测定管：分别添加8 μL样品和240 μL试剂一，37 ℃孵育5 min后测定450 nm处的吸光度值OD0；再加入60 μL试剂二混匀，37 ℃孵育5 min后测定450 nm处的吸光度值OD1，ΔOD测定管=OD0-OD1。

对照管：以双蒸水代替样品作为对照，其余条件与测定管一致，同样计算出ΔOD对照管。按公式(5)计算血清中TBIL含量(μmol/L)：

TBIL含量=887.211×(ΔOD测定管-ΔOD对照管)+0.549 2

(5)

1.2.7.4 血清中BUN含量的测定

测定管：分别添加0.02 mL样品、1 mL试剂一和1 mL试剂二，准确沸水浴15 min后立即用流水冷却，并测定520 nm处吸光度值。

标准管：分别添加0.02 mL 10 mmol/L BUN标准溶液、1 mL试剂一和1 mL试剂二，准确沸水浴15 min后立即用流水冷却，并测定520 nm处吸光度值。

对照管：分别添加0.02 mL 双蒸水、1 mL试剂一和1 mL试剂二，准确沸水浴15 min后立即用流水冷却，并测定520 nm处吸光度值。并按公式(6)计算血清中BUN含量(mmol/L)：

样品稀释倍数

(6)

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 抗生素敏感性

由于抗生素抗性基因可在食品或肠道内转移，因此用于食品的乳酸菌耐药性评价也已成为安全性评价的首要内容。本研究选择常用的抗生素药敏纸片氟哌酸、头孢拉定、庆大霉素、四环素、氯霉素和红霉素，无菌添加于涂布L.plantarumPMO的MRS平板培养24 h。其抑菌圈大小及对抗生素敏感程度如表1所示。根据《CLSI抗菌药物敏感性试验标准》标准判定，L.plantarumPMO对这些抗生素高度敏感。JIANG等[14]对L.plantarumWLPL04进行抗生素敏感性评价，结果表明WLPL04菌株对红霉素、氯霉素、庆大霉素和阿莫西林等敏感，但对卡那霉素、环丙沙星等具有抗性。SINGH等[15]对婴儿粪便中提取出的罗伊氏乳杆菌Lactobacillusreuteri菌株进行抗生素敏感性测试，发现菌株对氯霉素、红霉素敏感，但对庆大霉素等具有耐药性。相比而言，L.plantarumPMO安全性较高，应用时需避免与抗生素接触以免失活。

表1 L. plantarum PMO抗生素敏感性测定结果Table 1 Antibiotic sensitivity results of L. plantarum PMO

2.2 一般体征观察与急性毒性

以低、中、高浓度的L.plantarumPMO连续灌胃21 d，小鼠生长和精神状态良好、毛色光亮；饮食、饮水、排泄及活动正常，无中毒或死亡状况发生；解剖后肉眼观察各脏器无异常情况。灌胃期间各组小鼠体重变化如图2所示，雄鼠体质量(约43 g)均显著高于雌鼠(约33 g)(P<0.05)，但各剂量组与对照组间无显著差异(P>0.05)。这些情况表明L.plantarumPMO对小鼠生长无显著影响。根据GB 15193.3—2014《急性经口毒性试验》可认为L.plantarumPMO的半数致死量(LD50)>5×1011CFU/mL(bw)，20 mL/(kg·d)，为实际无毒级别。最大耐受剂量>5×1011CFU/mL(bw)，20 mL/(kg·d)。

图2 L. plantarum PMO对小鼠体质量的影响Fig.2 Effect of L. plantarum PMO on body mass of mice 注:不相同字母表示差异显著(P<0.05); 相同字母表示差异不显著(P>0.05)(下同)

2.3 细菌易位

细菌易位指细菌从胃肠道穿越肠道屏障到达血液、肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结等组织[16]。目前认为肠道细菌易位的发生涉及机体免疫功能状态[17]，肠黏膜上皮细胞等物理屏障和肠淋巴上皮组织抗感染、抗过敏作用[18]，肠道细菌的过度生长及肠血供状态[19]，巨噬细胞和细胞因子或炎性介质的复杂作用等多方面因素，可能引起免疫系统不健全或肠黏膜屏障功能障碍人群的益生菌相关菌血症。

通过MRS固体培养基和SS固体培养基对脏器表面、肠系膜淋巴结、脾脏、肝脏及血液的细菌的检测结果显示(表2)，这些部位及器官表面未检测到活菌，表明L.plantarumPMO未能通过肠道屏障到达肠系膜淋巴结及肠腔外的其他器官，不会发生细菌易位现象。同时，SS培养基上无菌落生长，表明L.plantarumPMO也不会引起肠道内沙门氏菌和志贺氏菌发生细菌易位的现象。

表2 不同剂量L. plantarum PMO的细菌易位试验Table 2 Bacterial translocation in different tissues of mice treated with L. plantarum PMO

2.4 脏器指数

肝脏和肾脏为重要解毒器官，其指数的变化程度也可反映灌胃成分毒性的强弱。由图3可知，各组小鼠灌胃后，心脏指数为0.50%～0.64%，肝脏指数为5.06%～5.55%，肾脏指数为1.53%～1.67%，脾脏指数为0.36%～0.39%。虽然各组雄鼠的心脏指数略低于雌鼠，肝脏指数和肾脏指数略高于雌鼠，但差异均不显著(P>0.05)。灌胃L.plantarumPMO的小鼠与对照组小鼠的各脏器指数相比，未表现出显著差异(P>0.05)，表明L.plantarumPMO对小鼠各脏

a-心脏指数；b-肝脏指数；c-肾脏指数；d-脾脏指数图3 L.plantarum PMO对小鼠脏器指数的影响Fig.3 Effect of L.plantarum PMO on organ indexes of mice

器无损害作用。

2.5 生化指标

2.5.1L.plantarumPMO对小鼠肝脏和血清中GOT酶活力的影响

临床表明，GOT含量与肝脏损害程度呈现显著相关性[20]，正常情况下，血清中GOT处于平稳状态，但心肌细胞和肝细胞受到损害时，GOT酶活力会随损伤程度而升高，因此可作为心肌细胞和肝脏是否受到损害的重要评判指标。

对小鼠肝脏GOT酶活力检测结果如图4所示，各剂量组与对照组间虽有差异，但差异不显著(P>0.05)。对灌胃L.plantarumPMO小鼠血清GOT的检测如图5所示，虽然剂量组的酶活力发生变化(18.12～22.07 U/L)，但未见显著差异(P>0.05)，因此认为L.plantarumPMO不会对心肌细胞和肝细胞造成损害。

图4 小鼠肝脏中GOT酶活力Fig.4 GOT activities in liver of mice

图5 小鼠血清GOT酶活力Fig.5 GOT activities in serum of mice

2.5.2L.plantarumPMO对小鼠肝脏和血清中GPT酶活力的影响

GPT在血液中含量较少，主要存在于肝细胞浆。当肝细胞肿胀、坏死或通透性增高时，GPT被释放进入血液，且升高的GPT会导致肝细胞的进一步损伤。因此GPT被作为肝功能损害的评价指标[21]。

小鼠肝脏GPT的测定结果如图6所示，各组小鼠的肝脏GPT酶活力处于大致相同的水平(37.48～41.16 U/g)。剂量组小鼠因个体差异，血清GPT酶活力在一定范围内波动(图7)，但与对照组无显著差异(P>0.05)，表明L.plantarumPMO灌胃不会造成肝脏功能、心肌细胞及骨骼肌的损伤。

图6 小鼠肝脏中GPT酶活力Fig.6 GPT activities in liver of mice

图7 小鼠血清中GPT酶活力Fig.7 GPT activities in serum of mice

2.5.3L.plantarumPMO对小鼠血清中TBIL含量的影响

TBIL为直接胆红素和间接胆红素的总和。衰老的红细胞释放血红蛋白,经代谢形成胆红素，包括游离胆红素和结合胆红素，分别经尿液和粪便排出。正常情况，血液中仅含微量胆红素，当肝细胞异常时会引起高胆红素血症，因此可作为肝功能和胆功能的重要指标[22]。小鼠血清TBIL的测定结果如图8所示，各组TBIL含量在10.47～12.02 μmol/L波动，性别和剂量都无显著差异(P>0.05)。因此可认为L.plantarumPMO不会对肝功能和胆功能造成损害。

图8 小鼠血清TBIL含量Fig.8 Content of TBIL in serum of mice

2.5.4L.plantarumPMO对小鼠血清中BUN含量的影响

BUN指血浆中除蛋白质外的含氮化合物，是人体蛋白代谢的主要终产物，经由肾小球过滤排出体外，肾功能不全时其含量升高。因此，血清BUN可作为判断肾功能的指标[23]。各剂量组小鼠的血清BUN含量在7.78～8.90 mmol/L范围内波动(图9)，性别和剂量都无显著差异(P>0.05)，表明L.plantarumPMO不会对肾功能造成损害。

图9 小鼠血清BUN含量Fig.9 Content of BUN in serum of mice

3 讨论

通过对植物乳杆菌L.plantarumPMO致病性和敏感性进行试验，结果表明，连续灌胃21 d，小鼠无中毒或死亡状况发生。根据GB15193.3—2014《急性经口毒性试验》 认为最大耐受剂量>5×1011CFU/(mL·bw)，20 mL/(kg·d)。L.plantarumPMO对氟哌酸、头孢拉定、庆大霉素、四环素、氯霉素和红霉素高度敏感，不会发生细菌易位现象。脏器指数及生化指标与对照小鼠无显著差异，对肝脏、心脏、肾脏及胆道的细胞和功能没有损害作用。

近年来，对于植物乳杆菌的安全性研究，在生物医学及大健康领域备受关注。研究证实植物乳杆菌L.plantarumGUO[24]、L.plantarumC88[25]、L.plantarumF22[26]等具有较高的安全性。具有益生菌潜力的植物乳杆菌用作辅助发酵剂可提高产品质量和安全性。GE等[27]从感官特性和理化指标方面评价，发现将金华火腿中的L.plantarumNJAU-01作为发酵剂能够改善干腌发酵香肠品质,这与研究表明L.plantarumT571能改善羊奶干酪品质的结论一致[28]。VALIPOUR等[29]实验证实了L.plantarumKC426951能调节小龙虾的肠道菌群，改善一些免疫参数及消化酶的活性，可作为龙虾养殖中的有益饲料。

随着研究的深入，越来越多新型益生菌逐渐被用于医药保健、食品、饲料和农业领域中，应用前景广阔。L.plantarumPMO具有良好的耐酸、耐低温和耐胆盐活性，作为益生乳杆菌具有良好的应用前景。实验表明，韩国泡菜中分离筛选的L.plantarumPMO对小鼠实验呈现较高安全性，可用于后续产品开发和深度利用。