HPLC-MS测定增强免疫力类保健食品中非法添加的13种药物成分

（河南省食品药品检验所，河南 郑州 450008）

增强免疫力类保健食品可补充机体所需营养成分，调节机体功能，提高免疫力。一些不法分子为求高额利润，向产品中添加针对性的化学药品，从而提高产品疗效，消费者食用后，会因摄入化学药物过量引起严重的不良反应，对消费者的身体造成严重伤害[1-3]。为进一步规范食品市场，2019年12月1日《中华人民共和国食品安全法实施条例》等政策正式实施，这也表明保健食品市场监管将更加严格。

目前，针对保健食品中非法添加物质的检测方法，最常用的是超高效液相色谱法（UPLC）[4]及液质联用方法（HPLC-MS），HPLC-MS一般采用多反应监测（MRM）模式[5-10]，这些方法存在检测时间长、容易出现假阳性结果等不足。本研究选取了增强免疫力类保健食品中常见添加的13个化学成分[11-12]，建立高效液相色谱-离子肼质谱（HPLCITMS）分析方法，利用ITMS的优点，选用MRM扫描触发增强子离子扫描（MRM-IDA-EPI），首先可采用MRM扫描进行定量分析和第一步定性分析，当MRM检测出超出预设值的信号时会触发增强子离子扫描（EPI），获得高质量子离子谱图，通过与谱库中对应化合物子离子谱图对比，达到进一步定性分析效果，完全避免假阳性结果。方法学验证及样品检验证明建立的方法可用于增强免疫力类保健食品中非法添加的药物成分的快速筛查及定量分析。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-30A超高效液相色谱仪（日本岛津）；QTRAP 6500+三重四级杆质谱仪（美国AB SCIEX）；Milli-Q超纯水器（美国密理搏公司）；KQ-600DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）；XPE205型电子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 对照品与试剂

那红地那非（批号：520039-201401，含量98.3 %，中国食品药品检定研究院）；红地那非（批号：520047-201401，含量99.9 %，中国食品药品检定研究院）；伐地那非盐酸盐（批号：26480，含量99.3 %，北京曼哈格）；枸橼酸羟基豪莫西地那非（批号：510032-201301，含量98.8%，中国食品药品检定研究院）；西地那非（批号：25530，含量99.9 %，北京曼哈格）；豪莫西地那非（批号：520046-201401，含量99.6 %，中国食品药品检定研究院）；氨基他达拉非（批号：520042-201401，含量99.8 %，中国食品药品检定研究院）；他达拉非（批号：25739，含量99.5 %，北京曼哈格）；硫代艾地那非（批号：26000，含量99.5 %，北京曼哈格）；伪伐地那非（批号：520041-201401，含量99.0 %，中国食品药品检定研究院）；那莫西地那非（批号：520040-201401，含量99.5 %，中国食品药品检定研究院）；去甲基他达拉非（批号：AL170606-14，含量98.56 %，Stanford Chemicals）；硫代西地那非（批号：26034，含量99.8 %，北京曼哈格）；甲醇，乙腈（色谱级，Merck）；甲酸（色谱级，Acros）；水为经Milli-Q超纯水器处理后的超纯水。鱼油软胶囊（1000 mg/粒，批号：817250601，威海南波湾生物技术有限公司），澳天力牌蜂胶软胶囊（500 mg/粒，批号：20180301-01，广东美丽康保健品有限公司），大保龙牌螺旋藻咀嚼片（250 mg/片，批号：20180404，南宁富莱欣生物科技有限公司），澳天力牌牛初乳咀嚼片（0.5 g/片，批号：20171101-01，广东美丽康保健品有限公司），怡生安康牌美龄丸（3 g/袋，批号：20180401，河南百消丹华南药业有限公司），正官庄牌高丽参精丸[210 mg/粒，批号：40238001，正官庄六年根商业（上海）]，均为河南省食品药检验所抽检样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters BEH-C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以0.1 %甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～3 min，88 %～15 %A；3～4 min，15 %A；4～4.5 min，15 %～88 %A；4.5～6 min，88 %A。流速0.4 ml/min；柱温40 ℃；进样量3 μl。

2.2 质谱条件

电离方式：电喷雾离子源；电离模式：正离子模式；检测方式：MRM-IDA-EPI；MRM扫描模式参数：气帘气（curtain gas）：30 psi；碰撞气（collision gas）：中等（Medium）；离子化电压：+5500 V；离子源温度：600 ℃；喷雾气：55 psi；辅助加热气：55 psi；EPI扫描模式的离子源参数与以上MRM扫描模式参数保持一致，各目标化合物监测离子对及相关参数设定见表1。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 分别准确称取适量上述对照品，用甲醇配制成500 μg/ml的贮备液，冷藏备用。取对照品贮备液各50 μl，置于同一25 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。再取混合对照品溶液适量，用80 %甲醇制成质量浓度分别为2，10，25，50，100 ng/ml的混合对照品溶液。

表1 13种非法添加药物的保留时间tR及质谱参数

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取样品（片剂、丸剂取适量研细，软胶囊和硬胶囊取适量内容物混匀）0.5 g于50 ml量瓶中，加80 %甲醇适量，超声30 min，放冷至室温，再定容至刻度，摇匀，离心（6000 r/min）5 min，取上清，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得，如果检出且含量较高，可再稀释适量倍数。

2.3.3 阴性样品溶液 取1.2项下胶囊剂、片剂和丸剂的阴性样品（即13种非法添加药物成分检验结果为阴性的样品）各2份，按2.3.2项下方法制成3种剂型的阴性样品溶液。

2.4 方法专属性考察

取上述阴性样品溶液、混合对照品溶液、加标阴性样品溶液，按2.1、2.2项下色谱和质谱条件进样，得到色谱和质谱图，3种溶液的总离子流色谱图见图1，MRM定量离子对色谱图见图2。结果表明，阴性样品溶液在每个离子对通道中均未见有干扰13种成分的色谱峰，且MRM定量离子对通道之间互不干扰，定量准确度好。上述3种剂型所含成分均不干扰目标物的测定，方法专属性较好。

图1 总离子流色谱图

图2 定量离子对色谱图

2.5 线性范围考察

取2.3.1项下混合对照品溶液，按2.1、2.2项下色谱和质谱条件进样，以目标组分定量离子的峰面积（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，见表2。结果表明，所有化合物在标准曲线范围内线性良好，相关系数r均在0.9939～1.0000范围内。

2.6 检出限（LOD）和定量限（LOQ）

在阴性样品中添加混合对照品溶液，用80 %甲醇逐步稀释后进样，以3倍信噪比计算各组分的LOD，10倍信噪比计算各组分的LOQ，结果见表2。结果表明方法具有很高的灵敏度，完全满足非法添加药物的检测要求。

2.7 进样精密度考察

取50 ng/ml混合对照品溶液，按2.1、2.2项下色谱和质谱条件进样，连续6次，记录各非法添加药物定量离子的峰面积，分别计算各成分峰面积的RSD，见表2。结果表明方法进样精密度良好。

2.8 回收率试验

取1.2项下胶囊剂、片剂、丸剂阴性样品各6份，每份精密称取0.5 g，分别置于50 ml量瓶中，各分3组，加入适量混合对照品溶液，按2.3.2项下方法分别制成0.5，2.0，5.0 μg/g添加水平供试品溶液。按2.1、2.2项下色谱和质谱条件，进行回收率试验，结果见表3。结果表明胶囊剂基质中，非法添加药物回收率均在70 %～112 %之间，片剂基质中，非法添加药物回收率均在66 %～112 %之间，丸剂基质中，非法添加药物回收率均在66 %～120 %之间，回收率良好。

表2 13种非法添加药物的线性方程、相关系数、LOD、LOQ

2.9 精密度试验

采用添加水平为2.0 μg/g的供试品溶液进行日内和日间精密度试验，按2.1、2.2项下色谱和质谱条件进样。日内精密度由每隔2 h重复测定6次得到，日间精密度由连续3 d重复取样测定得到。结果，日内精密度RSD控制在0.7 %～4.0 %；日间精密度RSD控制在1.0 %～5.0 %，表明方法精密度良好。

2.10 样品测定

本次研究共收集增强免疫力类保健食品近50批，按2.3.2方法配制样品溶液，按2.1、2.2项下色谱和质谱条件进样测定。若样品溶液中，有组分的色谱峰保留时间及相对丰度比与对照品一致，则可初步判定为检出该组分，然后与谱库中对应化合物子离子谱图对比，进一步判断。根据定量离子对的色谱峰面积，采用外标法计算样品中各非法添加药物的含量。结果50批样品中，有1批检验出西地那非，含量为24.3 mg/g，其余均未检出。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本研究考察了常用的Waters BEH-C18色谱柱和Waters T3色谱柱[10]在水-乙腈、0.1 %甲酸水溶液-乙腈、0.1 %甲酸水溶液-0.1 %甲酸乙腈溶液、10 mmol/L乙酸铵-乙腈4种流动相体系中的保留效果、峰型和质谱响应等，结果表明，C18柱明显优于T3柱；添加甲酸可明显提高质谱的响应值，以0.1 %甲酸水溶液-乙腈和0.1 %甲酸水溶液-0.1 %甲酸乙腈溶液流动相体系最佳，且两种流动相体系的质谱响应值无明显差别。综上，采用Waters BEH-C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和0.1 %甲酸水溶液-乙腈流动相体系，保留效果、峰型等均满足实验要求。最后对梯度洗脱程序进行了优化，保证了在短时间（6 min）内所有化合物得到较好的分离。

3.2 质谱条件的优化

本次研究利用了ITMS的特点，采用MRMIDA-EPI扫描模式。该扫描模式分为两步，首先采用MRM扫描模式，比较了正、负离子模式下13种非法添加药物的质谱响应，发现正离子模式下，响应更好，故选择正离子模式。选择合适的母离子，并在不同碰撞能量下对子离子进行优化，选择2个响应高且稳定的子离子，最后再对2个子离子的碰撞能量和去簇电压进行优化，并将响应相对较高的子离子作为定量离子，另一个作为定性离子。然后在EPI模式下，发现去簇电压为50 V，碰撞能量为35 V时，能得到满意的增强子离子扫描图。

3.3 谱库的建立

取50 ng/ml混合对照品溶液，按2.1、2.2项下色谱和质谱条件进样，利用得到的质谱数据建立13种添加物的二级质谱图谱库，见图3。

表3 13种非法添加药物回收率

图3 13种非法添加药物的增强子离子扫描质谱图

在实际进行样品检测时，采用MRM-IDA-EPI模式，首先进行MRM检测，可根据定性离子和定量离子的质谱图对样品进行第一步定性和定量。当某个通道探测扫描采集到的信号强度超过预设值时（即“出现色谱峰”），系统会触发EPI检测，获得二级质谱图。将二级质谱图与建立的谱库进行对比，并给出两者的相似程度结果，达到进一步的定性，避免“假阳性”现象。如图4为2.9项下检测出西地那非的增强子离子扫描质谱图，图5为样品与谱库对比图，与谱库中西地那非增强子离子扫描质谱图对比，相似度为88.6 %，进一步定性为西地那非。

图4 样品中西地那非的增强子离子扫描质谱图

图5 样品与谱库中西地那非增强子离子扫描对比图

4 结论

利用ITMS的IDA扫描模式成功建立了HPLCITMS联用法，能快速筛查和同时测定增强免疫力类保健食品中非法添加的13种药物成分。本方法分析时间短，定性准确性更高，提高了非法添加检测效率，对规范保健食品市场有重要意义。