雷公藤配伍甘草减毒大鼠体内尿液中的小分子代谢物以及相应生物代谢通路

王焕君 马致洁 董捷鸣 吴昊 于小红 段晓颖

摘要 目的：分析雷公藤配伍甘草减毒大鼠体内尿液中的小分子代谢物以及相应生物代谢通路。方法：选取30只SD大鼠正常饲养5 d，随机分为3组，即空白对照组、雷公藤组、雷公藤配伍甘草组，每组10只。应用HPLC-MS/MS-IT-TOF检测各组大鼠的尿液样本，并且按照偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）多元统计学方法以筛选并鉴定潜在的生物标志物;在此基础上推测其可能影响到的生物代谢通路。结果：大鼠尿液代谢组学分析结果显示，雷公藤配伍甘草组、雷公藤组和空百对照组分别聚集在不同的象限区域内;共鉴定出14个潜在的生物标志物，并且推测出嘌呤代谢和硒氨基酸代谢最具显著影响。结论：雷公藤配伍甘草减毒的机制复杂，其中可能通过调控嘌呤代谢和硒氨基酸代谢通路而实现。

关键词  雷公藤;甘草;配伍减毒;尿液;代谢组学;生物标志物;代谢通路;中药

Analysis of Toxicity Reduction on Tripterygium Wilfordii Combined with Radix Glycyrrhizae by Using Metabolomics of Rat Urine

WANG Huanjun¹，MA Zhijie²，DONG Jieming²，WU Hao²，YU Xiaohong²，DUAN Xiaoying³

（1 Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，China; 2 Department of Chinese Pharmacy，Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University，Beijing 100050，China; 3 The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）

Abstract Objective：To analyze the changes of small molecular metabolites in urine of rats administrated by tripterygium wilfordii combined with Radix Glycyrrhizae，and the involved metabolic pathways by metabolomics.Methods：On the basis of the previous experiment，the rats were given different experimental intervention，specifically divided into tripterygium wilfordii group，tripterygium wilfordii combined with Radix Glycyrrhizae group and blank control group; HPLC-MS/MS-IT-TOF was used to detect urine samples of rats in each group，and PLS-DA multivariate statistical method was used to screen and identify potential biomarkers.On this basis，it is speculated that it may affect the biological metabolic pathways.Results：The results of urine metabolomics analysis showed that the groups were clustered in different quadrants.We together identified 14 potential biomarkers and speculated that purine metabolism and selenoamino acid metabolism had the most significant effects.Conclusion：The mechanism of tripterygium wilfordii combined with Radix Glycyrrhizae is complex，which may be achieved by regulating purine metabolism and selenoamino acid metabolism pathway.

Keywords Tripterygium wilfordii; Radix glycyrrhiza; Compatibility toxin reduction; Urine; Metabolomics; Biomarkers; Metabolic pathway; Chinese medicine

中图分类号：R282;R285 文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.08.003〖HK〗

雷公藤载于《神农本草经》，其性凉、味苦、有大毒、归肝肾经，具有抗炎[1]、抗肿瘤[2]、祛风除湿、舒经活络、消肿止痛、杀虫解毒的功效。在临床上，雷公藤可用于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗，可发挥独特的治疗效果[3-5]。然而，伴随雷公藤发生的严重不良反应也是不可轻视的[6]，使其成为了近来出现中毒事件最多的中草药之一，尤其是雷公藤导致的肝毒性更是居单味药材肝损伤之首[7-8]。因此，针对于雷公藤的減毒存效研究是当前研究的重中之重。自古以来，配伍和炮制作为中药减毒增效的手段被广泛应用，如甘草能调和诸药，可解百药毒，被《神农本草经》列为药之上品，遵照“肝苦急，急食甘以缓之”的肝证治则。文献记载，甘草常用于有毒中药的配伍及炮制[9]，从中医脏象学说的角度来看，甘草能够缓和峻烈药物如雷公藤等的药性，调和脾胃、护肝保肝。现代药理学研究也证实，雷公藤与甘草配伍后可以减轻其肝毒性，而且通过优选配伍比例后分析其化学成分的改变[10]，但其确切的配伍减毒机制仍不明确。鉴于此，我们在前期工作基础上，进一步通过偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）以探究雷公藤配伍甘草后引起的大鼠体内尿液中内源性代谢物的改变，从而推测其可能影响到的代谢通路，也为配伍减毒机制的阐明提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选取SD（Sprague Dawley）大鼠30只，SPF级，体质量（180±20）g，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供[动物合格证号：SCXK（京）2011-0004]，实验动物分笼饲养于解放军第302医院实验动物中心。室内保持12 h光照黑暗循环，动物饲养使用的标准饲料和水以及所有动物实验均按照解放军302医院动物伦理委员会相关规定进行。

1.1.2 药物

雷公藤T.wilfordii生药材购自福建三明，经首都医科大学附属北京友谊医院赵奎君教授鉴定，为卫矛科雷公藤的干燥根;生甘草饮片购自于北京友谊医院中药房，经赵奎君教授鉴定为豆科植物胀果甘草的干燥根。

参照前期研究的药品制备方法，制备雷公藤提取物和雷公藤配伍甘草样品[11]。

1.1.3 试剂与仪器

甲醇（色谱纯，Fisher，批号：710741），乙腈（色谱纯，Fisher，批号：746105），甲酸（色谱纯，Fisher，批号：742317），LC-MS/MS-IT-TOF仪（日本岛津公司，Shimad-zu型），Waters XBridge C]18色谱柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm），超纯水器（美国Millipore公司，Gradient A10 Mill-Q型），超声提取清洗器（昆山市超声仪器有限公司，KQ5200E型），小型冷冻高速离心机离心机（Eppendorf，5424 R型）。

1.2 方法

1.2.1 分组

选取30只SD大鼠正常饲养5 d，随机分为3组，即空白对照组、雷公藤组、雷公藤配伍甘草组，每组10只。

1.2.2 给药方法

空白对照组给予生理盐水、雷公藤组灌胃给药雷公藤提取物15 g/kg、雷公藤配伍甘草组灌胃给药雷公藤配伍甘草提取物15 g/kg，（以雷公藤生药材计），连续给药14 d（上午9：00-]10：00），于末次给药后陆续收集大鼠的尿液。

1.2.3 检测指标与方法

于大鼠给药2周后收集尿液样本，并置于-80 ℃冰箱保存，待测。检测前将大鼠尿液于-80 ℃冰箱中取出，复融，取250 μL加入到1.5 mL EP管中，再加入甲醇溶液750 μL，混匀，静置，4 ℃下冷冻离心（10 000 r/min，10 min），取上清，并用0.22 μm微孔滤膜滤过，备用。

采用Waters XBridge  C18色谱柱（3.5 μm，]2.1 mm×100 mm）色谱柱;柱温为40 ℃，流速为]0.3 mL/min，进样量为5 μL，样品温度为4 ℃;液相洗脱条件：流动相A：水（1%甲酸），流动相B：乙腈（1%甲酸）。流动相梯度设置为：0～3 min，95%A;]3～5 min，95%～50%A;5～8 min，50%A;8～]10 min，50%～30%A;10～20 min，30%A;20～]22 min，30%～5%A;22～25 min，5%A;25～27 min，5%～95%A;27～35 min，95%A。

质谱参数设置：电离模式：ESI±;扫描范围：]100～1 000 m/z;离子源电压：4.5 kV;雾化器流量：1.5 L/min;干燥器（N2）：100 kPa;脱溶剂部温度：200 ℃;Ion Accumulation Time：30 ms;CID Energy：50%;检测器电压1.80～2.10 kV。

1.3 统计学方法

采用Profiling solution软件进行数据转换和色谱峰识别，然后将数据导入SIMCA 13.0软件，标准化处理后进行PLS-DA分析;运用VIP变量排序来预测各个变量对于拟合模型的贡献值，认为VIP>1者具有显著的贡献。再采用One-Way ANOVA的方法，依据P<0.05的原则，进一步排除上述潜在变量差异无统计学意义者;最后，将筛选出的显著差异性变量所对应的质荷比数值输入至Human Metabolome Database（HMDB）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库中进行匹配，进而推测可能的生物标志物;依据上述方法将寻找到的所有内源性代谢物的相关信息依次导入MetaboAnalyst代谢组数据综合分析平台（https：//www.metaboanalyst.ca/），进行代谢通路及富集分析。

2 结果

2.1 代谢轮廓分析

通过PLS-DA方法进行模型拟合，该模型的拟合参数R2Y为0.999，Q2为0.876，显示其准确度和预测度均良好。从图1中可以看出，雷公藤配伍甘草组（黑色圆圈）、雷公藤组（灰色圆圈）和空白对照组（白色圆圈）大鼠分别分布于不同的象限区域内，而微观体现在各组大鼠体内的内源性小分子代谢物水平的差异，进而导致了各组大鼠宏观上分布区域的不同。由此可知，雷公藤在大鼠体内发挥毒性作用的同时，其对应的内源性小分子代谢物的水平也发生了显著性的改变;然而当雷公藤与甘草配伍作用后，其在大鼠體内的毒性作用逐渐减弱甚至消失，此时发生异常改变的内源性小分子代谢物则表现出恢复正常水平的态势，在宏观上体现为接近空白对照组大鼠的区域内移动。

从图2中可以看出，每一个白色圆圈标识代表着不同的变量，其中距离坐标轴中心点越远的变量，其对模型拟合过程中各组分离度的贡献越大，也就是说这个变量所对应的潜在物质在各组大鼠体内的含量差异越大，即所谓的潜在生物标志物（内源性小分子代谢物）。图3中显示出不同变量的VIP重要性排序，VIP的数值越大，该变量在拟合模型中的显著性就越显著，通常我们选择VIP值>1为该变量差异有统计学意义，进而完成后面的生物标志物推测工作。

2.2 生物標志物筛查

本研究共鉴定出14个潜在的生物标志物，见表1，以及VIP值、质荷比、保留时间、标志物种类、加合形式、误差值及在各组大鼠尿液中的含量变化等信息。其中，与空白对照组比较，有4个生物标志物分别在雷公藤配伍甘草组和雷公藤组含量变化呈现出反向的趋势;10个生物标志物分别在雷公藤配伍甘草组和雷公藤组中则呈现出相同的含量变化趋势，但程度均各异。在微观水平上我们可以发现，当甘草发挥调和雷公藤肝毒性的同时，其体内对应的内源性小分子代谢物也发生着一定的改变，大多数均表现出与毒性作用相反的含量调整或在某种程度上中和其改变的趋势，进而促使代谢物水平进行有序的转归变化。

2.3 代谢通路及富集分析

将上述鉴定出来的14个生物标志物相关信息导入至MetaboAnalyst代谢组学在线分析数据库，查看代谢通路及富集分析的相关结果。发现与雷公藤配伍甘草减毒过程相关的代谢通路有4个，分别为嘌呤代谢（Purine metabolism）、硒氨基酸代谢（Selenoamino acid metabolism）、磷脂代谢（Sphingolipid metabolism）和嘧啶代谢（Pyrimidine metabolism），如图4A和表2所示。其中嘌呤代谢在雷公藤配伍甘草减毒的过程中-log（P）值最大，即相关性最强;硒氨基酸代谢在雷公藤配伍甘草减毒的过程中Impact值最大，即显著影响性最大。富集分析结果，如图4B所示，嘌呤代谢和硒氨基酸代谢的显著相关性最强，其次为嘧啶代谢。

3 讨论

病理组织形态学检查HE染色结果显示，雷公藤组大鼠的肝脏组织损伤明显，而雷公藤配伍甘草组大鼠的肝组织则未见明显的损伤;再者，相关生化指标（AST、ALT、CRE、UREA、ALB）和炎性反应递质（IL-1β、IL-6、TNF-α）结果数据也提示雷公藤配伍甘草后可有效降低其肝毒性。因此，我们认为雷公藤配伍甘草可对肝脏起到一定的减毒保护作用[11]。

前期研究结果证实了甘草配伍雷公藤后可以有效地降低雷公藤的肝毒性反应，具体地体现为肝脏病理组织、肝功生化指标和炎性反应递质的水平改善等[11-14]。而且，我们通过研究大鼠血清代谢组学的变化，发现了甘草配伍雷公藤后可以具体地作用于甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、α-亚油酸代谢等生物代谢通路。同样地，我们在上述研究基础上，专门针对于甘草配伍雷公藤减毒大鼠尿液代谢组学进行研究，进一步发现减毒作用可能涉及到的其他未尽发现的生物代谢通路，以更好地诠释体内作用机制。

雷公藤配伍甘草的这一用药组合来源于传统中医古方中的相关记载，也具有悠久的临床使用经验。本研究依据代谢组学的技术手段，比较了雷公藤组大鼠与雷公藤配伍甘草组大鼠以及空白对照组大鼠之间尿液样本的微观差异，结果显示上述3组大鼠分别聚集在不同的象限区域内，同时也体现出不同组别大鼠体内的小分子代谢物水平相互之间存在着一定的差异性。再者，雷公藤配伍甘草组大鼠的分布区域介于雷公藤组和空白对照组之间。我们推测大鼠在受到雷公藤肝毒性的影响后，其体内的小分子代谢物水平相比于正常大鼠出现了一定程度的偏离;而甘草通过发挥减毒功效后，这些发生异常改变的小分子代谢物则表现出了相应的转归趋势，即含量朝着正常的方向变化。

我们采用了多元统计方法PLS-DA来筛选这些具有显著改变的小分子代谢物，并且通过HMDB数据库和metlin数据库推测这些代谢物的种类及性质，进而将其作为鉴定出的生物标志物。本研究鉴定出14个潜在的生物标志物，其中涉及到胸苷酸激酶、脂肪酸、脂肪酰基糖苷、神经氨酸、神经酰胺、氨基酸、溶血卵磷脂、核糖核苷、鞘磷脂、肌酐三磷酸、白三烯、尿核苷、甲硫氨酸类物质。我们发现嘌呤代谢通路和硒氨基酸代谢通路的显著影响性最高。我们认为嘌呤代谢和硒氨基酸代谢与雷公藤肝毒性的发生密切相关，而甘草配伍后则可以通过调整这些代谢通路，促使其转归为正常状态。其中，SAICAR（KEGG：C04823）和ITP（KEGG：C00081，Inosine triphosphate）作为嘌呤代谢通路中的关键靶点;Se-Adenosylselenomethionine（KEGG：C05691）作为硒氨基酸代谢通路中的关键靶点，二者均发挥着不可或缺的作用。

雷公藤的毒性作用不仅体现在肝脏，在肾脏中也具有一定的毒性[15]。譬如本研究发现的嘌呤代谢和硒氨基酸代谢通路均与肾脏功能有着很大的联系，一旦肾脏功能出现紊乱，那么与肾脏相关的代谢通路相应也会发生一定程度的改变。中医辨证论治中以甘草配伍雷公藤实现减毒，在缓解体内脏器器官的毒性作用前提下，同步也改善着异常紊乱水平的代谢通路，实现表里合一的微宏观作用。

参考文献

[1]钟点，陈渊，赵伟.雷公藤红素抗炎及免疫抑制的研究进展[J].药物生物技术，2018，25（1）：64-69.

[2]张培光.雷公藤多苷联合醋酸泼尼松治疗肾病综合征患者的临床疗效及安全性[J].中国药物经济学，2019，14（11）：89-91.

[3]Bao J，Dai SM.A Chinese herb Tripterygium wilfordii Hook F in the treatment of rheumatoid arthritis： mechanism，efficacy，and safety[J].Rheumatol Int，2011，31（9）：1123-1129.

[4]Jiang M，Zha Q，Zhang C，et al.Predicting and verifying outcome of Tripterygium wilfordii Hook F.based therapy in rheumatoid arthritis：from open to double-blinded randomized trial[J].Sci Rep，2015，5：9700.