头穴围刺对缺血再灌注大鼠脑组织血管生成素-2和血管内皮细胞生长因子表达的影响

师帅 栾凯迪 李虹霖 王玉珏 夏昆鹏 张金朋 马祺昊 孙琦月 佟晓薇 韩盛旺

摘要 目的：觀察头穴围刺对缺血再灌注大鼠血管生成素-2（Ang2）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响。方法：选取30只健康雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和围刺组，参照Zea-Longa报道的线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型，围刺组给予头穴围刺治疗，3组分别于21 d取大鼠脑组织，采用HE染色观察大鼠脑组织缺血结构的变化;免疫组织化学观察大鼠脑缺血阳性细胞表达情况;采用Western检测Ang-2、VEGF蛋白表达水平。结果：针刺21 d后mNSS评分围刺评分优于模型组;与模型组比较，大鼠脑组织病理细胞数减少，差异有统计学意义（P<0.05）;针刺21 d后与模型组比较，大鼠脑组织缺血区域Ang-2、VEGF阳性表达明显增加，差异有统计学意义（P<0.05）;针刺21 d后与模型组比较，大鼠脑组织Ang-2、VEGF蛋白增多，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：头穴围刺可上调大鼠缺血再灌注区脑组织Ang-2、VEGF蛋白的表达，促进梗死区血管新生，帮助脑缺血再灌注损伤后的脑神经修复，降低神经功能缺损程度。

关键词 头穴围刺;脑缺血再灌注;神经功能缺损;促血管生成素-2;血管内皮生长因子;脑神经修复;血管新生

Effects of Scalp Acupoint Encircling Needling on the Expression of Ang-2 and VEGF in Brain Tissue of Rats with Ischemia-Reperfusion Injury

SHI Shuai1，2，LUAN Kaidi1，LI Honglin1，2，WANG Yujue1，2，XIA Kunpeng1，2，ZHANG Jinpeng1，2，Ma Qihao1，SUN Qiyue 1，TONG Xiaowei1，HAN Shengwang1，2

（1 The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University Of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China; 2 Heilongjiang University Of Chinese Medicine，Harbin 150000，China）

Abstract Objective：To observe the effects of scalp acupoint encircling needling on the expression of Ang-2 and VEGF in rats with ischemia-reperfusion injury.Methods：A total of 30 healthy male Wistar rats were randomly divided into a sham operation group，a model group and an encircling needling group，with 10 rats in each group.Rat cerebral ischemia-reperfusion model was prepared by thread embolization method reported by Zea-Longa.The encircling needling group was given scalp point encircling needling.The brain tissues of each group were taken from 21 days in 3 groups，and the changes of cerebral ischemic structure were observed by HE staining.Immunohistochemistry was used to observe the expression of positive cells in cerebral ischemia in rats，and Western Blot was used to detect the expression of Ang-2 and VEGF.Results：1）21 days later，the mNSS score and encircling needling were better than the model group.2）HE staining：Compared with the model group，the number of pathological cells in rat brain tissue decreased（P<0.05）.3）After 21 days of acupuncture，compared with the model group，the positive expression of Ang-2 and vascular endothelial growth factor in the ischemic area of rat brain tissue was significantly increased after immunohistochemical treatment（P<0.01）.4）Compared with the model group，the number of Ang-2 and vascular endothelial growth factor protein in the brain tissue of rats increased 21 days after acupuncture（P<0.01）.Conclusion：Scalp acupoint encircling needling can up-regulate the expression of Ang-2 and VEGF protein in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury，promote angiogenesis in infarcted area，help the repair of brain nerve after cerebral ischemia-reperfusion injury，and reduce the degree of neurological deficit.

Western检测：大鼠断头取脑，将组织匀浆裂解，离心去沉淀，取上层清液。按照BCA试剂盒要求测量蛋白质浓度，取等浓度等体积上样变性蛋白，SDS-PAGE（10%）电泳2 h以后，半干转膜法转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，一抗孵育过夜，VEGF（1∶1 000稀释），Ang-2（1∶500），温度保持4 ℃，TBST清洗膜5次×5 min，加入二抗（1∶8 000稀释）室温孵育2 h，TBST清洗5次×5 min，用ECL显色，于数字成像系统下显影，采用Image J检测条带密度。实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，在对比实验中涉及到2个数据集之间的数据，使用2个独立样本t检验的，方差不齐时采用近似t检验，阳性率之间的比较采用卡方检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能障碍评分比较

针刺干预21 d后，与模型组比较，针刺组神经功能却讯评分明显变小，其差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 HE染色结果

假手术组：大鼠大脑神经细胞排列趋势紧密，神经元形态规则，无组织水肿现象，散见少量的凋亡小体和炎性细胞，血管无充血。模型组：大鼠大脑神经细胞排列趋势稀疏且紊乱，神经元形态不甚规则，细胞数量显著增加，可见大量炎性细胞和凋亡小体，毛细血管肿胀。针刺组：大鼠大脑病理改变较模型组有明显好转。大鼠大脑神经细胞排布更加规则、分布趋势相对紧密，神经元细胞核固缩数目及炎性细胞数目显著增加，毛细血管肿胀情况也有所改善。见图1。

2.3 各组免疫组织化学结果比较

与假手术组比较，模型组大鼠Ang-2、VEGF阳性表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）提示脑缺血后会诱导血管新生;与模型组比较，针刺组Ang-2、VEGF阳性表达显著提高，差异有统计学意义（P<0.05）。提示在头穴围刺治疗下血管新生明显增多，且针刺组较模型组脑组织致密。见表2、图2，3。

2.4 各组Western检测结果

图4从左至右灰度逐渐加深，说明大鼠脑损伤后，Ang-2、VEGF蛋白表达逐渐增加，而针刺介入后，Ang-2、VEGF蛋白表达增加更明显。由此表明头穴围刺可明显上调Ang-2、VEGF蛋白的表达，促进大鼠脑组织缺血半暗带血管新生。

3 讨论

脑缺血的治疗中针灸作为一种临床中广泛应用的治疗手段取得了良好的疗效，并广泛受到学者的重视。头穴围刺疗法属于一种特殊针法，它基于脑梗死区在大脑皮质的投影区域通过腧穴治疗作用的“近治作用”，以达到改善脑缺血的目的，其理论来自于《灵枢·官针》篇的杨刺，取其用4根针围剿病灶集中治疗的理论基础。围刺也是通过多根针刺围剿病灶以产生“针场效应”来调整大脑皮质功能，对于病灶集中围刺以期在短时间内缩小病灶减轻病损程度治疗脑及神志相关性疾病。我们在早期研究中已证实头穴围刺不仅能够减低脑梗死大鼠神经功能缺损程度，还能上调内源性神经生长因子，起到保护脑神经的作用。因此，本实验采用头穴围刺疗法对脑缺血再灌注大鼠模型进行干预，观察其对血管生成因子及血管内皮生长因子的影响，进一步探讨头穴围刺法促进梗死区血管新生，改善梗死区血液供应，促进缺血半暗带组织恢复，帮助代偿梗死核心区循环功能，帮助快速建立有效血液循环，进而帮助受损的神经功能快速回复，最大化降低后遗症状。

血管与神经既各司其职又相辅相成，血管输送具有营养物质的血液以营养神经，神经在神经元神经细胞的作用下又对血管起到调节的功能，因此，二者关系紧密。梗死区血管堵塞，周围血管出現系列炎性反映导致梗死中心及周围血管状态不佳，血液流通不畅，无法营养周围的神经细胞，进而出现了脑组织的坏死。脑梗死的梗死灶周围存在半缺血区，我们称之为半暗带，这些微血管密度与脑中风患者的生存时间有密切关系，及时抢救半暗带，开放侧支循环已成为治疗脑梗死的必要环节。因此，诱导有效血管再生对于治疗脑梗死是一种有前景的方法[8]。VEGF是一种通过内皮组织细胞可以特异的有丝分裂原，目前被认为是特异性最高、作用最强的促血管新生因子，它既可以使血管内皮细胞增殖又可以促进形成新的血管，还可以改善已受损的神经细胞成活状态，营养并保护部分神经，促使血管和神经重塑，对脑梗死的恢复及预后发挥着重要作用[9-11]。

新生血管由很多细胞因子共同作用形成，血管生成素（ANG）就是血管新生家庭细胞因子重要组成部分[12-14]，而Ang-2就是Ang家族中的非常重要一员，它能够调节血管收缩和痉挛，位于血管内皮的表面，是血管新生后管腔调节的重要因子。梗死后血管收缩和调节直接影响梗死周围供血环境，因此Ang-2可以改善脑梗死区供血状态[15-16]，研究表明，Ang-2对VEGF互相影响互相促进，二者具有协同作用，对脑梗死受损后的组织有促进血管新生的作用。

本研究表明，头穴围刺治疗21 d后大鼠梗死区组织形态较前致密，神经细胞排列均匀组织形态完整，血管密度较前增加，管腔较前完整。VEGF和Ang-2的阳性细胞数及蛋白表达均明显上升[17]。说明头穴围刺可以有效的促进梗死区血管新生，并且建立有效的血液供应，帮助损伤的脑组织恢复。

综上所述，头穴围刺可通过上调VEGF和Ang-2表达，促进缺血脑组织血管新生，提升新生血管有效功能，重构梗死区及缺血半暗带区微循环系统，减轻大鼠脑部梗死面积，降低大鼠神经功能损伤程度，为研究临床治疗脑梗死的机制提供一种新的的思路。但是本研究尚存不足，头穴围刺在梗死区重新建立起的血液循环及新生血管是否均为有效血管均能提供有效血供，尚需进一步实验进行量化证明。

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