嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌混合发酵菊芋泡菜的研究

徐清萍，郭苗苗，唐培鑫，任超凡，唐百芬，胡丽亚

(1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，郑州 450001；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，郑州 450001)

菊芋为菊科向日葵属多年生草本植物，是一种生态抗逆性强、生命力旺盛的能源作物[1]。菊芋可用于生产菊粉、果糖、乙醇、丁醇等多种生物制品[2,3]。将菊芋粉添加到面包中，可以试制菊芋面包[4]，制作菊芋饮料[5,6]。菊芋中含有菊糖、脂肪酸、萜类、酚酸类等多种生物活性物质[7]。目前国内的菊芋主要用于生产酱菜、动物饲料等初级产品。

菊芋用于制作泡菜，多采用高盐腌制的方式加工，这不仅影响了菊芋食品的口感，同时后期生产泡菜进行脱盐处理也增加了生产成本[8]。采用自然发酵的传统泡菜工艺，生产中的优势菌群有乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、肠杆菌属等[9]。在前期，由原料和环境带入的杂菌较多,致病菌污染的风险难以完全排除。与自然发酵相比，人工接种发酵具有亚硝酸盐含量低、总酸含量高、发酵速度快的优点。嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL为本实验室前期筛选，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有一定抑菌活性，有利于降低致病菌污染风险。本文主要将具有抗菌性能的嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL应用于菊芋泡菜发酵中，并研究接种量、加糖量、加盐量、发酵时间对嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL混合发酵菊芋泡菜的影响，研究抗菌性乳酸菌的应用对菊芋泡菜主要指标的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

食盐、白砂糖、甜菊糖苷：食品级，市售；菊芋：采收自郑州附近种植地。

嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL：郑州轻工业大学食品新产品新技术创新实验室保藏菌种。

MRS肉汤培养基：杭州百思生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

SHP-250智能生化培养箱 上海鸿都电子科技有限公司；LX-C35L灭菌锅 合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；YP20001电子天平 上海光正医疗仪器有限公司；UV-5500分光光度计 上海元析仪器有限公司。

1.3 发酵菊芋的制备

1.3.1 工艺流程

菊芋→清洗→晾干→切片→装坛→加香辛料液→接种→发酵→成品。

1.3.2 操作要点

配制番茄-黄豆芽-菊芋培养液[10]：称取20 g番茄，20 g黄豆芽，10 g菊芋，加入1 L水煮30 min，过滤后加入20 g葡萄糖，搅拌溶解，补水定容至1 L，灭菌，冷却后备用。

将嗜酸乳杆菌LA和乳酸乳球菌LL接入MRS肉汤培养基活化后，按1∶1的比例混合接种，总接种量2%(体积分数)，转接到番茄-黄豆芽-菊芋培养液中培养24 h，作为乳酸菌种液。

配制香辛料液，每1 kg水中，加入干辣椒30 g，生姜10 g，八角1 g，花椒1 g，白砂糖20 g，加热，煮沸。

菊芋清洗、晾干、切片，按香辛料液∶菊芋为3∶1(质量比)的比例倒入香辛料液，按比例加入白砂糖、食盐，拌匀，接种乳酸菌种液。分别考察接种量、加糖量、甜味剂用量、加盐量、发酵时间等对菊芋片发酵过程中总酸(以乳酸计)含量、亚硝酸盐含量、氨基酸态氮含量的影响。发酵期间定期取样测定发酵液中总酸(以乳酸计)含量、氨基酸态氮含量及菊芋片中的亚硝酸盐含量。

1.4 乳酸含量的测定

参考国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》。

1.5 亚硝酸盐含量的测定

参考国标GB 5009.33—2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》。

1.6 氨基酸态氮含量的测定

参考国标GB 5009.235—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》。

2 结果与讨论

2.1 不同接种量发酵菊芋泡菜

按香辛料液∶菊芋为3∶1(质量比)的比例，将菊芋、香辛料液倒入泡菜坛中，分别接种乳酸乳球菌LL、嗜酸乳杆菌LA混合种液2，5，10，20，50 g/kg，室温(25 ℃)下发酵7 d。发酵期间定时取样测定发酵液中总酸(以乳酸计)含量、氨基酸态氮含量及菊芋片中亚硝酸盐含量，结果见图1。

图1 不同接种量发酵菊芋时各指标的变化Fig.1 Changes of various indexes in the fermentation of Jerusalem artichoke with different inoculation amount

图1中(1)为乳酸乳球菌LL、嗜酸乳杆菌LA在不同接种量时，菊芋泡菜发酵液中总酸含量(以乳酸计)随时间的变化曲线。由图1中(1)可知，随着发酵时间的延长，产酸量逐渐增加，其中总酸含量(以乳酸计)在发酵前5 d时变化较快，发酵5 d后，总酸含量基本不再明显增加。接种量低于10 g/kg时，适当提高接种量，有利于提高发酵前期(3 d)发酵液的总酸含量；接种量高于10 g/kg时，各组间的总酸含量变化差异不大。发酵7 d时，不同接种量对应发酵液的总酸(以乳酸计)最低为10.01 g/L，最高为10.79 g/L。说明发酵液总酸含量主要受发酵时间的影响，适当增加接种量有利于提高产酸速度。

图1中(2)为乳酸乳球菌LL、嗜酸乳杆菌LA混合发酵在不同接种量时，菊芋泡菜发酵液中氨基酸态氮含量随时间的变化曲线。由图1中(2)可知，随着发酵时间的延长，氨基酸态氮含量呈现上升趋势，其中在发酵前3 d时，氨基酸态氮含量增加较快，发酵3 d后，变化逐渐趋于稳定。接种量主要在发酵前期对发酵液中氨基酸态氮含量的影响差异较大，适当提高接种量，发酵液中氨基酸态氮含量相对更高。发酵5 d后，各组间的氨基酸态氮含量相差不大。

图1中(3)为嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL混合接种，不同接种量时发酵菊芋片中亚硝酸盐含量的变化。由图1中(3)可知，采用嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL混合发酵，菊芋片中亚硝酸盐含量较低，其中亚硝酸盐含量相对较高的时间为发酵1 d或3 d，发酵5 d后，亚硝酸盐含量均低于5 mg/kg，不同接种量组间亚硝酸盐含量差异不大，发酵7 d，除个别组外，亚硝酸盐含量均低于4 mg/kg。亚硝酸盐含量在发酵过程中无明显的高峰，亚硝酸盐含量符合国家标准中的规定限量，酱腌菜制品中亚硝酸含量不得超过20 mg/kg。据相关报道，乳酸菌产生的亚硝酸还原酶和代谢产物乳酸，可降解和清除亚硝酸盐，从而降低泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量[11]。

综合考虑接种量对总酸、氨基酸态氮、亚硝酸盐含量的影响，接种量主要影响产酸速度和氨基酸态氮含量，适当提高接种量有利于缩短发酵菊芋到达合适总酸含量的时间。

2.2 不同加糖量时菊芋泡菜指标变化

按香辛料液∶菊芋为3∶1(质量比)的比例混合，接种乳酸菌混合种液20 g/kg，分别加白砂糖0，10，15，20，25，30 g/kg，室温发酵7 d，定时取样测定发酵液中总酸含量、氨基酸态氮含量及菊芋片中亚硝酸盐含量，结果见图2。

图2 不同加糖量发酵菊芋时各指标的变化Fig.2 Changes of various indexes in the fermentation of Jerusalem artichoke with different sugar additive amount

图2中(1)为不同加糖量时总酸含量随时间的变化曲线。由图2中(1)可知，随着发酵时间延长，发酵液中总酸含量增加，其中总酸含量(以乳酸计)在发酵前5 d时增长较快，发酵5 d后，总酸含量不再明显增加。与不添加白砂糖组相比，加白砂糖量高的发酵液总酸含量更高一些，但从各组间总酸含量的差值看，差值变化并不是很大。根据前期对嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL利用不同碳源的试验分析，与葡萄糖相比，嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL利用蔗糖产酸能力较弱，添加白砂糖(成分为蔗糖)对嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL混合发酵的结果测定也表明其在发酵菊芋前期对总酸含量变化的影响较小。

图2中(2)为不同加糖量时发酵液中氨基酸态氮含量随时间的变化曲线。由图2中(2)可知，氨基酸态氮含量基本在发酵5 d时达到高峰，此后又有所下降。与未加糖组进行对比，适当增加糖含量，有利于提高发酵液中氨基酸态氮的含量。发酵7 d时，各组间氨基酸态氮含量相差不大。

图2中(3)为不同加糖量时菊芋片中亚硝酸盐含量随时间的变化曲线。由图2中(3)可知，采用乳酸乳球菌LL、嗜酸乳杆菌LA混合发酵，亚硝酸盐含量在发酵1 d时相对较高，此后降低。与不添加白砂糖组相比，适当添加白砂糖，有利于降低发酵后期亚硝酸盐含量，但各组间的差值并不是很大。其中白砂糖添加量为20 g/kg时，亚硝酸盐含量在整个发酵期间均处于较低水平。

2.3 不同甜菊糖苷添加量时菊芋泡菜指标变化

甜菊糖苷是一种常用的甜味剂，乳酸乳球菌LL、嗜酸乳杆菌LA混合种液接种量20 g/kg，白砂糖20 g/kg，分别添加甜菊糖苷0，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3 g/kg，室温发酵7 d，定期取样测定，结果见图3。

图3 不同甜菊糖苷添加量发酵菊芋时各指标的变化Fig.3 Changes of various indexes in the fermentation of Jerusalem artichoke with different steviol glycosides additive amount

图3中(1)为甜菊糖苷在不同添加量时发酵液中总酸含量(以乳酸计)随时间的变化曲线。由图3中(1)可知，随着发酵时间延长，总酸含量增加，发酵前5 d增长较快，发酵5 d后，总酸含量不再明显变化。对比甜菊糖苷在不同添加量时对总酸的影响，甜菊糖苷添加量对发酵液总酸含量(以乳酸计)变化无明显影响。

图3中(2)为甜菊糖苷在不同添加量时发酵液中氨基酸态氮含量随时间的变化曲线。由图3中(2)可知，氨基酸态氮含量随时间延长而逐渐增加，发酵5 d时达到高峰，此后略有降低。不同甜菊糖苷添加量，发酵3～5 d时，甜菊糖苷在一定范围内适当提高，发酵液中氨基酸态氮含量有所提高，具体原因尚待进一步分析。发酵后期，各组间氨基酸态氮含量变化相差不大。

图3中(3)为甜菊糖苷在不同添加量时菊芋中亚硝酸盐含量随时间的变化曲线。由图3中(3)可知，亚硝酸盐含量在发酵1 d时最高，此后降低。在发酵前期，与不添加甜菊糖苷组相比，添加甜菊糖苷组亚硝酸盐含量略低于非添加组，发酵后期各组间亚硝酸盐含量与甜菊糖苷添加量无明显剂量关系。

2.4 加盐量对发酵的影响

乳酸乳球菌LL、嗜酸乳杆菌LA混合种液按接种量20 g/kg接入装有菊芋和香辛料混合液的泡菜坛中，加入白砂糖20 g/kg，甜菊糖苷0.15 g/kg，室温25 ℃发酵。考察盐添加量分别在10，30，50，70，90 g/kg时对乳酸菌发酵菊芋的影响。不同盐添加量对菊芋泡菜发酵的影响见图4。

图4 不同盐添加量发酵菊芋时各指标的变化Fig.4 Changes of various indexes in the fermentation of Jerusalem artichoke with different salt additive amount

由图4中(1)可知，盐的添加量对乳酸菌发酵产酸速度的影响较大。其中加盐量在10～30 g/kg时，总酸含量(以乳酸计)在发酵前3 d增长较快，发酵5 d后不再明显变化。随着加盐量的增加，发酵液中总酸含量增长速度变慢，加盐量越大，抑制作用越强。当加盐量达到90 g/L时，对乳酸菌发酵产酸具有明显抑制作用，接种发酵5 d后，总酸含量才开始明显增加。不同盐添加量时，发酵液中氨基酸态氮含量随时间的变化情况见图4中(2)。由图4中(2)可知，发酵液中氨基酸态氮含量在发酵前3 d增长较快，其后逐渐趋于稳定。与低浓度加盐量相比，加盐量为70～90 g/kg时，发酵前期高盐浓度对氨基酸态氮的形成或溶出有一定抑制作用。发酵5 d后，各组间差距减少。不同盐添加量时，菊芋片中亚硝酸盐含量随时间的变化情况见图4中(3)。由图4中(3)可知，盐含量较低(≤10 g/kg)时，发酵菊芋的亚硝酸盐含量在发酵1 d时相对较高；盐含量增加，发酵菊芋3 d时亚硝酸盐含量相对较高，发酵过程中无明显亚硝酸盐峰值。

从不同因素对嗜酸乳杆菌LA、乳酸乳球菌LL混合发酵菊芋的影响方面分析，影响各指标变化的主要因素为加盐量和发酵时间。其中，不同加盐量对发酵菊芋总酸含量变化有显著差异，直接影响着产酸速度。采用低盐发酵能使菊芋泡菜在较短时间达到理想酸度。发酵菊芋的总酸含量、氨基酸态氮含量、亚硝酸盐含量直接与发酵时间相关，在一定时间范围内，总酸含量、氨基酸态氮含量随发酵时间延长而增加至一定峰值后不再明显变化，或略有下降。亚硝酸还原酶和酸性环境(pH<4.0)是发酵蔬菜中亚硝酸盐降解的主要原因，此外，乳酸菌产生的细菌素也在其中起着重要作用[12]。采用具有抑菌活性的嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌混合发酵菊芋，通过测定也表明采用抗菌性乳酸菌发酵，能使发酵酸度较快地达到理想酸度，而亚硝酸盐含量在发酵过程中无明显高峰。抑菌乳酸菌主要对发酵蔬菜中的肠杆菌等有害菌有抑制作用，从而降低了发酵过程中的亚硝酸盐含量。

3 结论

乳酸菌发酵菊芋的总酸含量主要与时间、接种量和加盐量有关。无盐添加时，随时间延长，总酸含量增加，发酵5 d后总酸含量趋于稳定；接种量大时，总酸含量增长更快。加盐发酵时，盐浓度明显影响产酸速度，盐浓度越高，产酸速度越慢，盐浓度在90 g/kg以上时，对总酸的增长有明显抑制作用。

适当提高接种量，有利于发酵前期氨基酸态氮含量的增加，发酵5 d后，氨基酸态氮含量不再明显增加，或略有下降。

发酵菊芋中亚硝酸盐含量变化主要与时间有关，亚硝酸盐在发酵前3 d相对较高，发酵3 d后无明显亚硝酸盐高峰，采用嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌混合发酵菊芋能明显抑制亚硝酸盐峰值的形成。