超声波辅助酶解玉米胚芽脱脂粕预处理条件的优化

孙天颖，程红，张明站，任健*

(1.齐齐哈尔大学 食品与生物工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.黑龙江省玉米主食工业化工程技术研究中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006；3.黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

近年来，超声技术在食品的提取、干燥、灭菌、清洗等方面已得到深入研究[1]。近年来，由于超声波无污染且作用过程中无化学添加的优势，涌现出大批采用超声波辅助水解蛋白的相关研究，且生物活性肽的发展也是当下的热门话题。有研究表明，用超声波进行预处理后，能够使底物蛋白的分子结构发生改变，同时能加快酶和底物蛋白两者之间的能量以及物质传递，以提高蛋白酶解作用[2-4]。超声波辅助水解的原理主要是机械效应和活化效应。蛋白会受到超声波在介质中传播中瞬间产生出来的高强度剪切力，能够促使蛋白构象被改变甚至被降解，以这种方式来提高蛋白溶解度和酶解速度的方法称为机械效应。而活化效应更偏向于超声波传播时会产生高温、高压的空化现象，空化现象发生时，体系内的大分子化学键发生断裂从而被分解成小分子，以提高蛋白的水解作用[5,6]。

本文旨在研究超声波底物预处理对玉米胚芽粕酶解的影响，以水解度、水解物中可溶性蛋白含量及抗氧化活性为指标，优化超声波预处理玉米胚芽粕条件，提高酶解效率，也为玉米胚芽粕生物活性肽的资源化利用和相关产品发展奠定了理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

玉米胚芽脱脂粕：蛋白含量24.15%，自制；Alcalase碱性蛋白酶：无锡杰能生物工程公司；Flavourzyme风味蛋白酶：丹麦Novo Nordisk公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Tris等其他试剂均为分析纯。

1.2 主要设备仪器

智能超声波清洗器(型号DL-360E) 上海之信仪器有限公司；凯氏定氮仪(型号B324) 日立公司；紫外可见分光光度计(型号DU800) 贝克曼公司；pH计(型号PB-10) 上海精密科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅(型号HH.S21-1)、水浴恒温振荡器(型号SHZ-88) 上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 水解指标的测定

水解度的测定采用pH滴定法，可溶性蛋白含量的测定采用Folin-酚法，抗氧化活性的测定采用改进的邻苯三酚自氧化法——微量进样法[7]。

1.3.2 超声波预处理条件的优化

超声波功率、超声波时间、超声波温度是影响超声波预处理的三大因素。依次采用碱性蛋白酶(水解温度45 ℃，pH值10.5，反应时间180 min，加酶量5%(W/W))和风味蛋白酶(水解温度50 ℃，pH值6.2，反应时间240 min，加酶量3%(W/W))对玉米胚芽脱脂粕进行水解，每相隔一段时间提取一定量的酶解液，一部分立刻在100 ℃下加热20 min钝化酶活力，另一部分立即测定其水解度(pH滴定法)，4000 r/min下离心被钝化后的样品20 min，提取上清液，用以检测样品溶液中可溶性蛋白含量和抗氧化活性。以抗氧化活性为指标，设计三因素三水平正交试验(超声温度、超声功率和超声时间)，确定玉米胚芽脱脂粕酶解时最佳超声波预处理的条件。

1.3.3 超声波预处理酶解效果的比较

采取最佳双酶水解组合方式水解玉米胚芽脱脂粕，在此期间用超声波替代磁力搅拌器进行反应，测定间隔一定时间后样品的水解度、可溶性蛋白含量及抗氧化活性，通过上述指标选取最优条件。

2 结果与讨论

2.1 超声功率对水解效果的影响

本试验的超声功率选取360 W×(20%、40%、60%、80%、99%)作用于样品30 min，每组做3个平行，考察超声波功率对酶解效果的影响，试验结果见图1～图3。

图1 超声功率对水解度的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on hydrolysis degree

图2 超声功率对可溶性蛋白含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on soluble protein content

图3 超声功率对水解物抗氧化活性的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on antioxidant activity of hydrolysate

由图1～图3可知，超声波预处理中超声功率显著影响玉米胚芽粕的酶解作用。水解度、可溶性蛋白含量和抗氧化活性于双酶相比，在较低功率时略有增加。玉米胚芽粕酶解时间在0～7 h期间，360 W×40%的超声功率下酶解物的水解度、可溶性蛋白含量和抗氧化活性均高于其他超声功率，超声功率大于360 W×40%时，酶解物的水解度和可溶性蛋白含量逐步递减。原因是在溶液介质中低功率超声波作用有利于底物和酶的结合，过大的功率会产生空化作用，破坏其原材料，促使高功率超声作用下酶解物的抗氧化活性下降并且降低酶解效果，导致水解物的各项指标结果较低。综合考虑，最佳超声功率应为360 W×40%。

2.2 超声时间对水解效果的影响

本试验选择不同超声时间(10，20，30，40，50 min)，用超声波对玉米胚芽粕进行辅助酶解，反应结束后提取这5种不同酶解液的上清液检测其水解度、可溶性蛋白含量以及抗氧化活性，每组做3个平行，试验结果见图4～图6。

图4 超声时间对水解度的影响 Fig.4 Effect of ultrasonic time on hydrolysis degree

图5 超声时间对可溶性蛋白含量的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on soluble protein content

图6 超声时间对水解物抗氧化活性的影响Fig.6 Effect of ultrasonic time on antioxidant activity of hydrolysate

由图4～图6可知，反应时间由0 h增长到7 h时，30 min超声时间作用的玉米胚芽粕酶解液的水解度和可溶性蛋白含量均高于其他超声时间作用下的酶解液，虽然在1～3 h之间，30 min超声时间作用的酶解液的抗氧化活性较低，但整体作用效果均高于其他超声时间。超声处理玉米胚芽粕在30 min超声时间之前，还未来得及进行反应，只是促使体系变得更加均匀，在30 min时，玉米胚芽粕与酶充分结合反应达到最佳，当超声时间超过30 min以后，水解反应达到最大，此时水解趋势不再变化甚至有下降趋势。总之，选择30 min为最优的超声时间。

2.3 超声温度对水解效果的影响

本试验选择不同超声温度(20，30，40，50，60 ℃)，用超声波对玉米胚芽粕进行辅助酶解，反应结束后提取这5种不同酶解液的上清液检测其水解度、可溶性蛋白含量以及抗氧化活性，每组做3个平行，试验结果见图7～图9。

图7 超声温度对水解度的影响Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on hydrolysis degree

图8 超声温度对可溶性蛋白含量的影响 Fig.8 Effect of ultrasonic temperature on soluble protein content

图9 超声温度对水解物抗氧化活性的影响Fig.9 Effect of ultrasonic temperature on antioxidant activity of hydrolysate

由图7～图9可知，反应时间由0 h增长到7 h时，50 ℃超声温度作用的玉米胚芽粕酶解液的水解度、可溶性蛋白含量和抗氧化活性均高于其他超声温度作用下的酶解液。超声波本身是一种能够散发热量的能量形式，超声处理玉米胚芽粕在超声温度50 ℃以下时，超声波主要是以散发热量为主要形式，在这种环境下玉米胚芽粕能够吸收能量，以此来提高水解反应速率[8]，此时这种加热作用在50 ℃时，玉米胚芽粕与酶充分结合反应达到最佳，当超声温度超过50 ℃以后，会引起空化作用，导致部分底物被破坏，水解反应受到抑制。综上所述，选择50 ℃为最优的超声温度。

2.4 正交试验设计

本试验采取三因素三水平试验表L9(33)，3个因素分别为超声功率(A)、超声时间(B)和超声温度(C)，L9(33)正交试验因素水平表见表1，本试验采取的指标为抗氧化活性，确定最终最优条件的正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 L9(33)正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of L9(33) orthogonal test

表2 L9(33)正交试验方案及结果Table 2 Design and result of orthogonal test L9(33)

表3 方差分析结果Table 3 The result of variance analysis

由表2可知，超声波辅助酶解玉米胚芽脱脂粕预处理最优的条件是A2B2C3(超声功率360 W×40%，超声时间30 min，超声温度55 ℃)。由表3可知，超声功率对超声波辅助酶解玉米胚芽脱脂粕预处理具有极显著影响，超声时间也具有极显著影响，超声功率较超声时间更为显著，但超声温度却无显著性差异。通过最优条件反应后得到的玉米胚芽脱脂粕酶解液的水解度为36.58%，其上清液中的抗氧化活性为514.67 U/mL，可溶性蛋白含量为21.06 mg/mL。

2.5 玉米胚芽粕的超声波酶解效果比较

玉米胚芽粕分别采用水浴双酶水解、超声波预处理+水浴双酶水解、超声波对整个酶解过程的处理3种处理方法，结果见表4。

表4 玉米胚芽粕不同处理酶解效果的比较 Table 4 Comparison of enzymatic hydrolysis effects of corn germ meal under different treatments

由表4可知，采用超声波预处理后再用水浴双酶水解方法水解后得到的玉米胚芽粕酶解物的水解度高于水浴双酶水解，又远高于超声波对整个酶解过程的处理方法；超声波预处理后再水浴双酶水解方法作用后的酶解物的可溶性蛋白含量也高于水浴双酶水解以及超声波对整个酶解过程的处理方法；超声波预处理后再用水浴双酶水解处理过的酶解物表现出的抗氧化活性是其他两种酶解方法近2倍的效果。以上证明，采取超声波预处理后再水解较传统水解方法而言，是一种更优的水解预处理条件，这种方法可以促使底物更充分反应，提高水解效率。

3 结论

本试验以玉米胚芽粕为研究对象，以水解度、水解物中可溶性蛋白含量及抗氧化活性为指标，在玉米胚芽粕水解时采用超声波(超声功率、超声时间以及超声温度各不相同)对其进行预处理，经数据处理分析可知，超声功率360 W×40%，超声时间30 min，超声温度55 ℃是超声波预处理的最优条件。并且超声波预处理后再水浴双酶水解是更为合理的方法，促使水解后的酶解物的抗氧化活性大幅度提升。为能够更高效水解底物提供了新的研究思路，也为超声波的深入研究提供了理论依据。