壳低聚糖对PM2.5 所致急性肺损伤的保护作用研究

游 航，唐 华，唐 华

随着我国工业化与城市化水平快速发展，雾霾已成为我国面临的一大难题。 暴露于过量的颗粒物(particulate matter，PM)中可增加罹患各种疾病的风险，导致死亡率上升[1]。 短期内大量接触PM 会提高因呼吸系统疾病而住院的风险。 2 d 内PM 的平均浓度升高10 μg/m3将会增加2.07%的呼吸系统相关疾病住院率[2]。 相反，当PM 平均浓度降低10 μg/m3时，平均寿命将会增加0.35年[3]。 PM 中导致肺组织损伤的主要成分是空气动力学直径≤2.5 μm 的细颗粒物(PM2.5)。 目前已有许多研究探讨PM2.5 对肺组织损伤的机制，伍晓丽等[4]发现PM2.5 引起肺组织损伤的机制主要是诱导氧化应激和炎症反应。 PM2.5 中的Mn、Zn、Pb 等金属成分可引起肺上皮细胞氧化应激，大量产生并释放脂质过氧化物，而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)则显著降低[5-6]。 PM2.5 上附着的多种病原体导致肺组织产生炎症并显著提高肺组织中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的浓度[7]。 壳低聚糖也称壳寡糖，是壳聚糖经过特殊处理降解得到的聚合度为2～10 的氨基葡萄糖低聚物[8]。 由于壳低聚糖糖链短，所以具有溶解性好和生理条件下粘度低的特点。 壳低聚糖具有抑菌、抗氧化应激、抗炎和免疫调节作用，也可以促进细胞修复和伤口愈合[9]。 本研究主要探讨壳低聚糖对PM2.5 暴露下急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的干预作用，为治疗PM2.5 所致ALI 的临床用药提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与仪器

1.1.1 动物 选用(30±2)g 雄性昆明种小鼠。 实验动物来自西南医科大学SPF 级动物中心，生产许可证号:SYXK(川)2018-065。

1.1.2 材料与试剂 壳低聚糖(脱乙酰度＞90%，分子量＜3000)购自山东奥康生物科技有限公司；总蛋白(TP)检测试剂盒、LDH、TNF-α ELISA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；蛋白酶抑制剂购自上海罗氏制药有限公司。

1.1.3 仪器与设备 低速离心机(TDZ6B-WS，上海卢湘仪离心机有限公司)；超声波清洗器(KB-250B，40 kHz，250 W，昆山舒美超声仪器有限公司)；K-C120H 型智能中流量采样器(青岛宜兰环保股份有限公司)；滤膜(d＝0.15 μm，上海兴亚净化材料厂)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5 样品采集和悬液制备 颗粒物采样点在西南医科大学图书馆楼顶，采集时间2018年12 月，连续采集1 个月。 无菌条件下将滤膜切至1 cm×3 cm 小片，浸泡在蒸馏水中，超声波震荡3 次，每次20 min，充分洗脱颗粒物。 含颗粒物液体经8层无菌纱布过滤，以转速12000 r/min，离心20 min。离心后的沉淀物经真空冷冻干燥后在-20 ℃保存。将颗粒物溶解于生理盐水，制成10 mg/mL 的PM2.5 混悬液，4 ℃保存。

1.2.2 小鼠分组与造模 健康雄性昆明种小鼠30只，随机分为5组，每组6 只，即空白对照组、ALI组、低剂量治疗组、中剂量治疗组及高剂量治疗组。适应性饲养1 周后，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，以10 mg/mL PM2.5 悬液进行气管滴注。 空白对照组用等量生理盐水代替，1 /d，连续3 d。

1.2.3 小鼠给药 末次染毒24 h 后，低、中、高剂量治疗组参考Liu 等[10]和郭剑平等[11]的方法，分别用浓度为10、20 和40 mg/mL 的壳低聚糖溶液灌胃，1 /d，连续10 d，空白对照组和ALI组用等量生理盐水代替。 最后一次灌胃24 h 后处死所有小鼠。

1.3 标本采集和指标检测

1.3.1 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 用4 ℃预冷的无菌生理盐水对左肺进行肺泡灌洗，每次0.6 mL，共3 次；全部收集后离心(3000 r/min，10 min)，取上清液检测LDH，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.2 肺组织匀浆 取右肺0.3 g，在冰浴中，用组织剪剪碎后加入9 倍体积预冷生理盐水，再加入1体积的酶抑制剂，研磨制成匀浆，离心(3500 r/min，10 min)，取上清液检测LDH 和TNF-α，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.3 心脏血清 取血1 mL，在室温下静置30 min 后离心(3000 r/min，10 min)，取上清液，检测SOD，严格按照试剂盒说明书操作。

1.3.4 肺组织病理切片 取余下右肺组织，用20倍体积质量分数为10%的甲醛溶液固定，48 h 后送至西南医科大学附属第一医院病理科制作病理学切片和HE 染色，观察肺组织形态学变化。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0 和Graph Pad 8.0 软件进行统计分析。 计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较使用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理切片形态学观察 对照组肺泡结构完整，大小分布均匀，肺泡间隔无增厚，肺泡腔无炎性渗出(图1A)。 ALI组未见完整肺泡结构，分布紊乱，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内有炎性渗出物伴有大量中性粒细胞炎性浸润(图1B)。 ALI组可见PM2.5 分散颗粒物沉积于气管灌注后的肺泡区，被肺巨噬细胞吞噬，表明PM2.5 可以到达肺泡区(图1C)。 低剂量治疗组肺泡大部分融合，但可见部分正常肺泡结构，肺泡间隔增厚减轻，肺泡腔内炎性渗出减少(图1D)。 中剂量治疗组大部分的肺泡结构完整，分布较均匀，间隔增厚明显减轻，肺泡腔内渗出物少，伴轻微中性粒细胞浸润(图1E)。 高剂量治疗组正常肺泡结构少，多数肺泡融合，肺泡炎性渗出和中性粒细胞浸润减轻(图1F)。 结果表明，壳低聚糖能明显改善PM2.5 所致的肺损伤。 其中中剂量治疗组效果相较于其他两个治疗组效果更好。

2.2 壳低聚糖对PM2.5 暴露下肺组织中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性的影响 与空白对照组比较，ALI组BALF 和肺组织匀浆中LDH 活性均显著增高(P＜0.01)，TNF-α 含量也明显升高(P＜0.01)，同时SOD 活性显著降低(P＜0.01)。 与ALI组比较，低、中、高剂量治疗组LDH 活性(BALF)分别降低8.68 U/gprot、10.51 U/gprot、8.70 U/gprot(P＜0.01)；LDH 活性(肺组织匀浆)分别降低59.56 U/g、79.53 U/g、47.20 U/g(P＜0.01)；TNF-α 含量分别降低111.70 pg/mL、222.60 pg/mL、116.60 pg/mL(P＜0.01)；SOD 活性分别升高36.52 U/mL、32.50 U/mL、19.52 U/mL(P＜0.01)。 各治疗组间比较，中剂量治疗组BALF 以及肺组织匀浆中LDH活性和TNF-α 含量降低更明显(P＜0.01)；低剂量治疗组SOD 活性升高更显著(P＜0.05)，图2。

图1 肺组织病理学改变(×200 倍)

图2 各组肺组织中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性测定结果

3 讨论

有研究表明，PM2.5 造成ALI 的机制主要包括氧化应激和炎症反应[12]。 TNF-α 是公认的促炎细胞因子，在炎症反应过程中产生早且作用显著，它通过激活NF-κB 传导通路，诱导IL-1B、IL-6 等多种炎性细胞因子释放，加快炎症反应进程，增加趋化因子的表达，呈现出级联瀑布效应[13]，进而造成组织细胞损伤[14]。 LDH 是一种胞质酶，在质膜损伤时大量释放[15]。 临床上常通过检测LDH 活性水平来辅助诊断组织器官损伤[16]。 SOD 是体内重要的抗氧化因子，其水平的提高被视为清除自由基的重要细胞防御机制[17]。 壳低聚糖糖链较短，分子量小，所以具有溶解性好，生理条件下粘度低的特点。 Zhang等[18]发现，壳低聚糖能有效地清除羟基自由基和超氧自由基。 Gai 等[19]发现在人脐静脉内皮细胞中，一定剂量的壳低聚糖不仅能抵抗过氧化氢的强氧化，而且能增加SOD 和谷胱甘肽过氧化物酶的含量，从而抑制过氧化氢等氧化物诱导的活性氧生成。Chen 等[20]发现壳低聚糖能增强静息中性粒细胞的活性，抑制中性粒细胞的过度活化，以保护身体免受急性炎症。 本研究旨在验证服用壳低聚糖可以减轻PM2.5 所致ALI 的假设。 壳低聚糖对PM2.5 暴露下肺组织中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性的变化及肺组织形态学观察结果表明:壳低聚糖可以通过降低肺组织中LDH 活性和TNF-α 水平，来减轻PM2.5 对肺组织的炎性损伤；还可以通过升高抗氧化因子SOD 的活性来减轻PM2.5 引起的氧化应激损伤。 另外，结果显示，肺组织匀浆和BALF 中的LDH 活性以及TNF-α 含量均在中剂量治疗组中降低最为显著，这与肺组织病理形态学改变结果一致。而肺组织匀浆中SOD 活性却在低剂量治疗组中增高最明显。 对于造成这种不同趋势的原因，本研究推测:①壳低聚糖对PM2.5 暴露下肺损伤的保护作用可能主要通过抗炎症反应来实现；②壳低聚糖对PM2.5 暴露下肺损伤的保护作用机制随浓度不同而存在差异，即在低浓度时，可能主要通过抗氧化应激，而在较高浓度时，则主要通过抗炎性损伤。 Timmerman 等[21]发现BALF 中炎症细胞分类计数可定量反映肺炎症反应，通过检测各组BALF 中的炎症细胞分类计数可进一步验证本研究结果。

综上所述，本研究结果初步表明壳低聚糖可通过降低炎性损伤和抗氧化应激减轻PM2.5 所致的肺损伤，且保护作用与给药剂量存在一定的量效关系。 相关作用机制尚待进一步研究证实。