鱼腥草中总黄酮的工艺筛选及其抗氧化性研究

罗益远 ，陈宏降，刘师行 ，苏 淇，李 敏*

（1.浙江医药高等专科学校中药学院，宁波，315100；2.吉林农业科技学院中药学院，吉林132101）

鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分，始载于《名医别篇》，是一种可做食物也可做药材使用的植物。苦、甘，寒。归肝、胃经。具有清热解毒，消肿散结，利尿通淋功效，为治肺雍之要药[1～2]。主要用于疔疮肿毒，乳痈，瘰疬，目赤，咽痛，肺痈，肠痈，湿热黄疸，热淋涩痛。现代药理研究表明,鱼腥草中黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗诱变和清除自由基等功能[3～4]。黄酮的提取率及其抗氧化性的强弱，决定着鱼腥草黄酮的开发利用价值。

纤维素酶在现实生活中有着很广泛的运用，是一种辅助作用性能很强的水解纤维素复合酶，使用水酶法可以降低消耗、并且能够减少化学试剂的用量，使得实验条件和环境温和的优点，这相对于传统的浸出法和压榨法而言有着不少传统方法无法比拟的优点。这些年来，以广泛运用于中草药主要成分的提取研究中[5～8]。本试验以鱼腥草为原料，采用纤维素酶协同超声波提取法进行变量对比实验对鱼腥草中总黄酮的提取工艺进行筛选，并对其抗氧化性进行研究。旨在为鱼腥草药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考，为鱼腥草的进一步研究提供技术基础。

1 仪器与试药

CP114型电子分析天平（奥豪斯仪器有限公司）；752紫外-可见分光光度计 （上海奥谱勒仪器有限公司）；THC-5B型数控超声波提取机（济宁天华超声电子仪器有限公司）；TD6K低速离心机 （长沙东旺实验仪器有限公司）；40目标准筛 （浙江上虞市道墟五四仪器厂）；芦丁（批号：0080-9705，购于中国药品生物制品检定所）；纤维素酶（≥50U/mg）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、无水乙醇等（以上试剂均为分析纯）。

试验鱼腥草药材样品为2019年实地采集，药材采集后净制，趁鲜剥去外皮后干燥，即的。所有样品均鉴定为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分。留样保存于吉林农业科技学院药物分析实验室。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的制备

精确称取芦丁标准品2mg，配制为100mL 0.02mg/mL的芦丁标准溶液。用10mL的容量瓶进行0.1mL到0.5mL的浓度梯度的稀释，每个梯度相差0.1mL，分为5个梯度。用50%乙醇溶液补至2mL后用移液管移取0.3mL 5%Na2NO2溶液加入其中，振荡过后静置6min。再分别移取0.3mL 10%Al(NO3)3溶液加入容量瓶中，摇匀过后静置6min。再分别加入用移液管移取的质量分数4%NaOH溶液2mL，振荡后用50%乙醇溶液定容至10mL，振荡后静置15min。以蒸馏水做空白对照，在500nm下测定吸光度，以吸光度y为纵坐标，样品浓度x为横坐标，得到回归方程：y=7.55x+0.0757，r2=0.9992。

图1 芦丁标准曲线

2.2 提取工艺流程

提取鱼腥草中总黄酮的工艺流程：鱼腥草粉末→加入纤维素酶溶液→破壁水解→煮沸，使酶灭活→乙醇浸提，超声波处理→离心→收集上清液→定容→得到总黄酮供试品溶液[13,14]。

2.3 鱼腥草中总黄酮含量测定

用移液管精密量取2.0mL供试品溶液至10mL的具塞试管中，用50%乙醇溶液补至4mL，加入用移液管移取的 5%Na2NO2溶液0.3mL，振荡后静置6min，在移取10%Al(NO3)3溶液0.3mL加入，振荡后放置6min，加入用移液管移取的2mL 4%NaOH溶液并振荡，用50%乙醇溶液定容，摇匀后静置15min。在500nm下测定吸光度，计算黄酮提取含量。

总黄酮提取率（%）=[(C·V1·V2)/(V3·M)]·100%

式中，C为总黄酮浓度，mg/mL；V1为溶液稀释体积mL；V2为样品溶液的体积，mL；M表示称取的药品质量，mg；V3表示取样体积，mL。

2.4 单因素试验

2.4.1 料液比对总黄酮提取率的影响

准确称取5份过40目筛的鱼腥草粉末1g于100mL锥形瓶中,分别加入10mL水，调整pH为5.0。分别加入浓度为0.2mg/mL的纤维素酶溶液2mL，密封瓶口，在40℃的恒温水浴锅中水浴15min后将酶液置于90℃的恒温水浴锅中水浴5min。分别加入体积分数为 50%的乙醇溶液 10、20、30、40 和 50ml， 然后在进行超声波提取，设定功率为500w，时间为50 min，离心后取上清液定容为100mL。测其吸光度，试验重复3次。结果见图2。

图2 料液比对黄酮提取的影响

对以上数据进行分析，结果见表1，得处理组间P＜F0.05，即不同的料液比对鱼腥草中总黄酮的提取率在F0.05时不存在差异显著性。为了考察最佳提取工艺的因素，此料液比将不作为正交试验的考察因素。

表1 料液比对提取率影响的方差分析表

2.4.2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响测定

准确称取5份过40目筛的鱼腥草粉末1g于100mL锥形瓶中，分别加入10mL水，调整pH为5.0。分别加入浓度为0.2mg/mL的纤维素酶溶液2mL，密封瓶口，在40℃的恒温水浴锅中水浴15min后将酶液置于90℃的恒温水浴锅中水浴5min。在按1∶30的比例将一定浓度的乙醇溶液加入其中 （浓度分别为30%、40%、50%、60%和70%），密闭瓶口。在超声波下进行50min的提取，超声功率设置为500w，离心后吸取上清液定容到100 mL。测定吸光度，重复3次试验。结果见图3。根据计算出的黄酮百分含量，得出方差分析表见表2。结果显示处理组间P＜0.05，即乙醇不同的体积分数对鱼腥草中总黄酮的提取率在F0.05时存在差异显著性。为了进一步乙醇浓度的用量对黄酮提取效果的影响及水平间的差异影响，对该因素进行多重比较，详见表3。

经过方差分析和多重比较可知，不同的乙醇浓度30%与40%、50%之间存在极显著差异，60%、70%与50%之间存在极显著差异，60%与50%之间有显著差异，50%与40%之间差异显著，70%、60%、40%之间差异不显著。在50%浓度下黄酮含量达到最高，为1.7523%。所以选取50%及左右两水平（40%和60%）乙醇浓度作为正交试验的水平。

图3 乙醇浓度对黄酮提取的影响

表2 乙醇浓度对黄酮提取率影响的方差分析表

表3 乙醇浓度对黄酮提取率影响的多重比较

2.4.3 提取时间对总黄酮提取率的影响

精密称取1g鱼腥草粉末于100mL锥形瓶中，然后在每一个锥形瓶里面加上10mL的水，在把每一个的pH调节到5.0之后，分别加入浓度为0.2mg/mL的纤维素酶溶液2mL，密封瓶口，在40℃的恒温水浴锅中水浴15min后将酶液置于90℃的恒温水浴锅中水浴5min。在1∶30的料液比例将50%的乙醇溶液加入其中，密封瓶口。然后在超声波（500w）下进行一定时长的提取（提取时间分别为 20、30、40、50 和 60min），离心，取上清液定容到100mL。测定其吸光度，重复3次。结果见图4。根据计算出的黄酮百分含量，得出方差分析表见表4。结果显示得处理组间P＜0.05，超声波处理时间的长短不同对鱼腥草中总黄酮的提取率在F0.05时存在差异显著性。为了进一步考察超声波处理时间对黄酮提取效果的影响及水平间的差异影响，对该因素进行多重比较，详见表5。

经过对方差分析和多重比较可知，当超声波处理时间为30min时与其他各组超声波的处理时间的总黄酮提取率有着显著差异，60min与40min和30min处理时间之间有着显著差异，60min与20min和50min处理时间之间的差异不显著，超声波处理时间为30min时黄酮的提取率达到最大，约为1.8629%，所以选取20、30、40min作为正交试验的水平。

图4 提取时间对黄酮的影响

表4 提取时间对黄酮提取率影响的方差分析表

表5 乙醇浓度对黄酮提取率影响的多重比较

2.4.4 超声功率对总黄酮提取率的影响

准确称取5份过40目筛的鱼腥草粉末1g于100mL锥形瓶中，分别加入10mL水，调整pH为5.0。分别加入浓度为0.2mg/mL的纤维素酶溶液2mL，密封瓶口，在40℃的恒温水浴锅中水浴15min后将酶液置于90℃的恒温水浴锅中水浴5min。在按1∶30的料液比加入50%的乙醇溶液，密封瓶口。将超声波功率设定为 400、500、600、700和 800w提取时间设置为50min后进行提取，离心，取上清液定容到100mL。测定其吸光度，重复三次试验。结果见图5。根据计算出的黄酮百分含量，得出方差分析表见表5。结果显示得处理组间P＜0.05，即在该水平下超声波处理功率对鱼腥草中黄酮的提取率有显著性差异。为了进一步考察超声波处理功率对黄酮提取效果的影响及水平间的差异影响，对该因素进行多重比较，详见表6。

经过对方差分析和多重比较可知，超声波处理功率600w、700w与其他各组超声处理功率有极显著差异，超声处理功率700w与600w之间，400w、800w、500w之间差异不显著。在超声波功率为600w时，黄酮百分含量达到最大为1.7680%，所以选取500w、600w、700w作为正交试验的水平。

图5 超声功率对黄酮的影响

表5 提取时间对黄酮提取率影响的方差分析表

表6 乙醇浓度对黄酮提取率影响的多重比较

通过对以上4个单因素的分析，得出结果为：超声波处理时间、乙醇浓度、超声波功率对鱼腥草中总黄酮提取率有显著影响，即在F0.05时有差异显著且；料液比对鱼腥草中总黄酮提取率影响差异不显著。所以选择超声波处理时间、乙醇浓度、超声处理功率三个因素进行正交试验。

2.5 正交试验

为了能够更方便的考察提取总黄酮的工艺参数，对单因素试验结果进行分析，在本次实验中以纤维素酶的使用量、超声波的处理时间、超声波处理功率、乙醇溶液浓度分别做为单因素实验的变量并进行相互对照实验分析，从而测得提取液中的总黄酮的含量值，用L9（34）正交表设计试验[9]。 根据单因素分析，选出超声波处理时间为20、30、40min，提取剂的体积分数为 40%、50%、60%，超声波处理功率 500、600、700w。以此作为正交试验的考察因素及水平。表7设计的L9（34）正交表进行正交试验。以总黄酮含量为指标，进一步考察，详见表8。结果数据进行分析，比较各因素的提取率，我们可以得到最佳的提取工艺为：超声时间30min，乙醇浓度60%，超声波处理功率600w，即总黄酮提取工艺的最佳组合为A2B3C2。比较各因素提取率均值极差之间的大小，极差越大，该因素对提取率的影响越大，乙醇浓度＞超声时间＞超声功率，即鱼腥草黄酮的提取含量的影响大小依次为：B＞A＞C。

表7 正交试验因素水平设计

表8 正交试验结果

2.6 优化工艺的重现性试验

根据正交试验确定的最佳提取工艺进行3次优化工艺的重现性试验，并通过试验结果来表明该提取工艺的稳定性与可行性。试验结果见表9。结果显示黄酮平均百分含量为2.8227%，RSD=0.8759%,表明此试验稳定性强。

表9 验证试验结果

2.7 鱼腥草中黄酮的抗氧化研究

测试方法：配置浓度分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mg/mL 的黄酮样品溶液各 2mL，在 25℃恒温水浴锅中进行预热后分别加入2.5mL 0.1mmol/LDPPH的无水乙醇溶液，摇匀避光充分反应30min，在520nm下测定吸光度，以未加入样品溶液的DPPH无水乙醇为空白参比，同时以VC做对阳性对照。测定吸光度，重复3次试验，取其均值。根据3次重复试验的所得的吸光度值，按公式计算出黄酮样品液及Vc对DPPH自由基的清除率，结果见图6。

DPPH溶液中自由基的清除率={（A0-Ax）/A0}*100%

其中A0表示空白对照组的吸光度，Ax黄酮样品溶液的吸光度。

结果显示，黄酮类化合DPPH自由基的清除作用与Vc溶液相当，说明其具有较强的抗氧化能力，并且在一定范围内清除作用随着黄酮类化合物浓度的提升而增加。当浓度低于0.2mg/mL时DPPD溶液的自由基清除率随着黄酮浓度的增加而急剧增加，当浓度高于0.2mg/mL时，黄酮浓度对DPPH溶液自由基的清除率的的影响逐渐减小而趋于平缓。

图6 黄酮溶液及Vc溶液对DPPH的自由基清除率

3 小结

本试验以鱼腥草为原料，采用纤维素酶协同超声波提取法进行变量对比实验对鱼腥草中总黄酮的提取工艺进行筛选，并对其抗氧化性进行研究。所得工艺合理，抗氧化活性较高，为鱼腥草的进一步研究提供技术基础。