响应面法优化羊栖菜褐藻多酚提取工艺

蔡 圣 宝， 李 美 奇， 易 俊 洁

( 昆明理工大学 农业与食品学院， 云南 昆明 650500 )

0 引 言

羊栖菜(Hizikiafusiformis)作为一种可食用的海洋藻类植物[1]，广泛分布于我国的浙江沿海一带，含有多种活性物质，营养价值高，其中羊栖菜褐藻多酚是羊栖菜中重要的活性物质之一，约占藻体干重的2%，主要为间苯三酚衍生物及连苯三酚衍生物，具有抗氧化[2]、抗菌[3]及抑制代谢酶[4]等作用。目前，褐藻多酚的提取方法多种多样，主要包括有机溶剂提取法、超声提取法、微波提取法、酶提取法和临界流体萃取法等[5]。吕成林等[6]和张丽斌等[7]等均通过乙醇溶剂提取法对羊栖菜多酚提取工艺进行了优化，但是提取率不高。为了获得更高的提取率，采用其他方式辅助乙醇进行提取。

方丽等[8]用二次正交旋转法优化超声辅助提取羊栖菜多酚，但未对超声功率的影响进行探究。本实验选取超声功率、乙醇体积分数、料液比、提取时间等影响条件，采用响应面分析法，探讨超声辅助乙醇提取羊栖菜褐藻多酚的最佳工艺条件，以期为羊栖菜褐藻多酚生物活性探索以及后期的开发利用提供科学理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜羊栖菜(Hizikiafusiformis)，浙江省洞头区；Folin-Ciocalteu试剂，Merck公司；没食子酸标准品；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SpectraMax M5型多功能酶标仪，美国Molecular Devices；JN-5200DTS型超声，宁波市科技园区新江南仪器有限公司；真空泵，德国Vacuubrand。

1.3 方 法

1.3.1 羊栖菜多酚提取方法

准确称量羊栖菜5.0 g，按一定料液比加入一定体积分数乙醇溶剂。在40 ℃下，超声辅助提取一定时间，用布氏漏斗进行抽滤。滤液转入100 mL容量瓶定容，精密吸取提取液1 mL，在10 mL容量瓶中稀释10倍后，测定总酚质量分数。

1.3.2 单因素试验

固定提取温度40 ℃，依次改变乙醇体积分数、超声功率、料液比、提取时间等因素。各因素的水平梯度为乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%，超声功率180、210、240、270 W，料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 g/mL，提取时间30、60、90、120 min，考察不同提取条件对羊栖菜多酚提取量的影响。

1.3.3 褐藻多酚提取量的测定

羊栖菜不同提取液中褐藻多酚提取量以总酚质量分数表示。总酚质量分数测定采用Folin-Ciocalteu法并加以修改[9]，取1 mL原液稀释后，向其中加入去离子水6 mL，再加入0.5 mL福林试剂，静置1 min，加入1.5 mL 20% Na2CO3，用去离子水定容至10 mL。70 ℃水浴中加热10 min，冷却至室温，用多功能酶标仪在765 nm波长下分别测定各反应液的吸光度。以没食子酸标准品制作标准曲线，多酚提取量表示为没食子酸质量/羊栖菜质量(mg/g)，所有试验重复3次。

1.3.4 响应曲面优化试验设计

如表1所示，在单因素试验的基础上，根据响应面Box-Behnken设计原理，选取料液比(A)、超声功率(B)、乙醇体积分数(C)、提取时间(D)4个因素为变量，以褐藻多酚提取量为响应值，采用4因子3水平的响应面分析法，得到二次回归方程，并得出最佳工艺参数[10]。

表1 Box-Behnken响应面设计试验因子与水平Tab.1 Variables and levels in response surface design

1.4 数据统计分析

所有试验操作均重复测定3次，结果表示为(平均值±标准偏差)，结果利用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行显著性分析，P<0.05认为有显著性差异(采用Tukey检测)，统计学分析和作图均在Origin 8.5软件中完成。采用Design Expert 8.0.6软件建立二次响应回归模型。

2 结果与分析

2.1 乙醇体积分数对褐藻多酚提取量的影响

如图1所示，随着乙醇体积分数的增大，褐藻多酚提取量呈现先增大后减小的趋势。当乙醇体积分数达到60%时，褐藻多酚提取量达到最大。出现增加趋势的原因可能是褐藻多酚含有酚羟基，易与蛋白质、多糖等以氢键和疏水键形成稳定化合物，而乙醇可以断裂氢键，且褐藻多酚的溶解度会随乙醇体积分数的增大而逐渐增加[11]，最终使褐藻多酚提取量增高。当乙醇体积分数过高时会引起羊栖菜中脂溶性成分浸出较多[12]。

图1 乙醇体积分数对褐藻多酚提取量的影响Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction of phlorotannins amount from Hizikia fusiformis

2.2 超声功率对羊栖菜褐藻多酚提取量的影响

如图2所示，在超声功率为180～240 W时，羊栖菜褐藻多酚提取量随着超声功率的增大而升高，当超声功率达到240 W时，褐藻多酚提取量达到最大值，这可能是由于超声产生的机械作用和空化效应破碎了植物细胞壁，有效成分呈游离状态溶入提取溶剂中[10]，可见一定功率的超声处理可以促进褐藻多酚的提取。随着超声功率继续增大，褐藻多酚提取量明显下降，这可能是由于超声产生的机械应力过大，增加了植物组织细胞损伤，使多酚氧化酶和过氧化物酶大量分泌，从而发生氧化导致酚类物质质量分数有所下降[13]，进而造成褐藻多酚提取量下降。

图2 超声功率对褐藻多酚提取量的影响Fig.2 The effect of ultrasound power onthe extraction of phlorotannins amount from Hizikia fusiformis

2.3 料液比对褐藻多酚提取量的影响

如图3所示，褐藻多酚提取量随着料液比增大呈现增大的趋势，当料液比达到1∶10时，褐藻多酚提取量达到最大，为0.804 mg/g，这可能是由于较多的溶剂进入植物组织细胞，使酚类化合物更容易渗透到溶剂中[11]，从而使提取量上升。但当料液比继续升高时，提取剂对有效成分的提取能力达到饱和，因此增加提取液的比例会使杂质竞争溶出，并不利于有效成分地提取[14]，同时还可能造成溶剂的浪费，增加成本。

图3 料液比对褐藻多酚提取量的影响Fig.3 The effect of solvent to material ratio on the extraction of phlorotannins amount from Hizikia fusiformis

2.4 提取时间对褐藻多酚提取量的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，褐藻多酚提取量逐渐上升，在30～60 min上升较明显。在60 min后，褐藻多酚提取量的上升程度逐渐降低，这可能是因为在60 min内羊栖菜的有效提取物已基本提取完成，适当的延长超声时间会增加褐藻多酚提取量，但是过长时间的超声会对羊栖菜的营养成分产生一定的机械损伤，同时增加能耗和成本，所以选取最佳提取时间为60 min。

图4 提取时间对褐藻多酚提取量的影响Fig.4 The effect of extraction time on the content of total phenol

2.5 响应面法提取条件优化

2.5.1 二次响应回归模型的建立与分析

响应面设计如表2所示。表中1～24为析因实验，25～29为中心实验。29个实验点分别是分析因点和零点，析因点是自变量在A、B、C、D组成的三维顶点，零点是区域中心点，零点实验重复5次，用于实验误差的估计[10]。

表2 响应面实验设计与结果Tab.2 Design and results of response surface experiment

利用Design Expert 8.0.6进行回归拟合，得到提取条件与褐藻多酚提取量之间的二次多项回归方程为

Y=0.97+0.039A+0.022B-0.000 44C+

0.003 75D-0.012AB-0.019AC+

0.039AD-0.043BC+0.001 33BD-

0.009 765CD-0.064A2-0.052B2-

0.048C2-0.075D2

多项式中，Y为羊栖菜褐藻多酚提取量的预测值，A、B、C、D分别代表料液比、超声功率、乙醇体积分数、提取时间的编码值。

表3 回归方程系数显著性检验表Tab.3 Significance test of regression coefficients

料液比和超声功率对羊栖菜褐藻多酚提取量影响极为显著，乙醇体积分数和提取时间对羊栖菜多酚提取量不显著。由F值可知，各因素对于羊栖菜褐藻多酚提取量的影响由高到低依次为料液比(A)、超声功率(B)、时间(D)、乙醇体积分数(C)。AD、BC、A2、B2、C2、D2极显著，AC效果显著，AB、BD、CD间效果不显著。本实验中模型拟合效果较好，可以用来对羊栖菜的褐藻多酚提取量进行分析和预测。

2.5.2 各因素交互作用对褐藻多酚提取量的影响

由图5可知，两因素间的交互作用极显著。这与表3中方差分析的回归模型显著性结果一致，表明褐藻多酚提取量在一定范围内有极大值。

(a) 料液比与反应时间

(b) 超声功率和乙醇体积分数图5 有显著相互作用的两因素对褐藻多酚提取量影响的响应面图Fig.5 Response surface plots of the effect of two variables on phlorotannins extraction

2.5.3 最佳反应条件的预测及验证

通过回归模型的预测，得到超声辅助提取羊栖菜中褐藻多酚类物质的最佳提取工艺为料液比1∶15，超声功率217 W，提取时间69 min，乙醇体积分数57%，此时褐藻多酚提取量的理论值最大，为0.941 mg/g。结合生产实际，各因素水平调整为料液比1∶15，超声功率220 W，提取时间70 min，乙醇体积分数57%，在此条件下进行验证实验，重复3次实验，测得褐藻多酚提取量为(0.930±0.036) mg/g，与理论值误差仅为1.169%，证实了该模型具有有效性。

3 结 论

采用响应面分析法得到超声辅助乙醇提取羊栖菜褐藻多酚的最佳工艺条件：料液比1∶15，超声功率217 W，提取时间69 min，乙醇体积分数57%。在此条件下，模型预测值为0.941 mg/g，验证实验所得多酚提取量为0.930 mg/g，误差仅为1.169%，表明该模型能较好地预测羊栖菜褐藻多酚提取量。超声辅助乙醇提取法对提高羊栖菜褐藻多酚的提取率具有显著效果，应用前景较好，该成果也为下一步羊栖菜褐藻多酚生物活性探索提供了前期理论基础。