疏肝和胃丸对糖尿病胃轻瘫模型大鼠胃电节律及胃窦Cajal 间质细胞表达的影响

林辉，孙必强，黄群

（1.湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012；2.湖南中医药高等专科学校附属第一医院，湖南 株洲 412000）

0 引言

糖尿病胃轻瘫（diabetic gastroparesis,DGP)为糖尿病常见慢性并发症[1]，胃窦Cajal 间质细胞 (interstitial cells of Cajal，ICC）作为胃肠道动力的起搏细胞，能通过调节胃肠平滑肌细胞内的慢波，从而掌控胃肠道的自主节律运动。有研究表明[2]ICC 的数量减少、功能降低、超微结构破坏等是导致糖尿病患者胃肠平滑肌正常收缩功能发生障碍的重要机制。基于ICC 已经成为治疗DGP 的重要靶点，本研究从ICC 表达和胃电节律角度，探索疏肝和胃丸治疗DGP 的相关机制。

1 材料与方法

1.1 动物

Wistar 大鼠150 只，60-80 日龄，体重（200±20）g，雄性，湖南省斯莱克景达实验动物有限公司提供（许可证号：SYXK（湘）2011-0003），饲养温度25℃，湿度50%，分笼喂养，自由进食进水。

1.2 药物与试剂

多潘立酮片（10 mg/片，西安杨森制药有限公司生产，国药准字：H10910003）。注射用链脲佐菌素（Steptozotocin，STZ，美国Sigma 公司）；柠檬酸（天津市博迪化工有限公司）；兔抗c-kit 多克隆抗体(一抗)(武汉博士德生物公司)。

疏肝和胃丸中药饮片由本校中药教研室采购经鉴定为真品，按每剂中加蒸馏水500 mL，煎煮40 分钟，过滤，浓缩为浸膏，每克浸膏含生药18.75 g，冷藏备用。

1.3 造模方法及分组

高糖高脂饲料喂养2 周，禁食不禁水12 h，编号后随机抽取10 只为正常组，余为造模组。参照文献[3]造模：造模组动物在第1 天和第8 天分别两次腹腔注射新鲜配制1%STZ 液，注射剂量为45 mg/kg，正常组大鼠相应腹腔注射0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液，注射剂量为1 mL/只。第2 次STZ 注射后6w 尾尖采血测空腹血糖（Fasting Blood Glucose，FBG）。选取FBG＞16.7 mmol/L 同时伴有腹部胀大、体质量减轻等胃轻瘫症状动物随机分为模型组、西药组、疏肝和胃丸低、中、高剂量组，每组20 只。

1.4 给药方法

西药组每日按临床剂量1 倍（0.5 mg/kg）给予多潘立酮灌胃，疏肝和胃丸低、中、高剂量组按临床剂量1 倍（生药1.5 g/kg）、2 倍（生药3.0 g/kg）、4 倍（生药6.0 g/kg）每日灌胃，给药体积均为10 mL/kg，模型组与正常组予等体积蒸馏水灌胃，连续给药4 周。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 胃电节律的测定

大鼠禁食、禁水12 h，固定，采用10%乌拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉，腹部脱毛，75%酒精脱脂，采用美国MP150 型多导生理信号仪采集体表胃电描记。测定胃电慢波主频率和主功率，描记30 min。

1.5.2 胃窦ICC 数量的检测

取幽门附近胃窦组织约1.0 cm×1.0 cm，生理盐水冲洗、4%多聚甲醛固定24 小时，常规石蜡包埋、间断连续切片、脱蜡、抗原修复。滴加c-Kit-抗体(按1:100 稀释)，37 ℃恒温箱孵育2 h，先后滴加生物素标记的二抗和链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，恒温箱孵育15 min，DAB 显色2 min 左右。常规脱水透明，中性树胶封片，显微镜观察染色情况。阳性结果判断：细胞胞浆染色呈棕褐色者判定为阳性表达。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠胃电节律与胃窦ICC 表达的比较

其他各组胃电主频率、主功率均低于空白组，差异显著（P＜0.01）；疏肝和胃丸各组胃电主频率、主功率显著高于模型组（P＜0.01），低于西药组（P＜0.05），疏肝和胃丸各组胃窦ICC 表达显著高于模型组（P＜0.01），低于西药组（P＜0.05），详见表1。

2.2 胃窦ICC 数量的检测结果

光学显微镜下可见：在胃窦组织肌层之间夹杂者形状为圆形或边缘不规则的细胞即为c-kit 阳性ICC 细胞。见图1 所示，空白组c-kit 的ICC 阳性细胞表达数量较多。图2 示，与空白组比较，模型组大鼠c-kit 呈（+）的ICC 表达减少(P＜0.05）；与模型组比较，疏肝和胃丸高中低剂量组大鼠c-kit呈（+）的ICC 表达显著增加(P＜0.05）。

表1 各组大鼠胃电节律与胃窦 ICC 表达的比较（±s）

表1 各组大鼠胃电节律与胃窦 ICC 表达的比较（±s）

注：a 与空白组比较P＜0.01；b 与模型组比较P＜0.01；c 与西药组比较P＜0.05

图1 空白组

图2 模型组

图3 高剂量组

图4 中剂量组

图5 低剂量组

图6 西药组

3 讨论

DGP 的发病机制目前仍不清楚，其中以ICC 为代表的组织学变化受到重视。ICC 数量的减少和形态结构变化受多种因素调控，SCF/c-kit 信号通路在参与ICC 的增殖、分化以及表型维持等生理过程其中起着重要的作用[4]。当c-kit 受体被SCF 活化后，c-kit 与SCF 结合，通过活化细胞内的酪氨酸激酶及磷脂酰肌醇-3 激酶 (PI3K) 激活多个信号途径，调节细胞基因表达[5]。电针[6]与中药[7]均可通过促进mSCF 蛋白表达，上调SCF/c-kit 信号通路，增加DGP 大鼠胃窦组织内ICC 数量。

根据DGP 的临床表现可归于“胃痛”、“胃痞”、“呕吐”范畴，病机上当属气病，乃脾胃虚弱，肝气横逆克土，胃气上逆所致。疏肝和胃丸是一临床使用多年经验方，具有疏肝和胃，降逆止呕，行气止痛之功，由柴胡、佛手、姜半夏、木香、柿蒂等八味中药组成，临床用于DGP 治疗效果较好。前期实验研究显示该方可通过增加胃粘膜血流量而具有较好的胃粘膜保护[8]及促胃肠动力作用[9]。前期实验研究显示该方促进DGP 模型大鼠胃肠动力可能与调节血清胃肠激素含量有关[10]。本研究显示造模后，模型组动物胃电节律与胃窦ICC 数量等指标结果较空白组显著降低（P＜0.01）。经疏肝和胃丸治疗后，以上指标得到显著提高（P＜0.01），提示疏肝和胃丸促进胃肠蠕动机制可能与调节胃窦组织SCF/c-kit信号通路，促进ICC 的增殖、分化有关，其中的机制值得进一步深入研究。