罗非鱼下脚料酶解制备降血糖肽的工艺研究

赵阔　王涛　陈艳　张红建　邹易　梁爱文　郑联合

摘 要：研究以罗非鱼加工下脚料为原料制备降血糖肽的工艺。从5种常用蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶）中筛选出了碱性蛋白酶作为目标酶;之后通过单因素试验和正交试验对碱性蛋白酶水解工艺进行优化，得到最适酶解条件：温度50 ℃、加酶量1 000 U·g-1、pH9.5、底物濃度6%，此工艺条件下水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率分别达到28.19%和30.12%。

关键字：罗非鱼加工下脚料;降血糖肽;酶解;α-葡萄糖苷酶抑制率

Abstract：The experiment was carried out to study the preparation technology hypoglycemic peptide with tilapia heels as raw material by enzymatic hydrolysis. Firstly， studied the enzymolysis effect of five enzymes （pepsin， trypsin， alkaline protease， neutral protease， and papain） respectively on tilapia heels， and acreened the alkaline protease as target enzyme. Then optimization hydrolysis conditions were carried out through mono-factor and orthogonal experiments： temperature 50 ℃， the amount of enzyme 1 000 U·g-1， pH 9.5，substrate concentration 6%. Under this condition， the hydrolysis degree and α-glycosidase inhibition rate were 28.19% and 30.12%， respectively.

Key words：Tilapia heels; Antihypertensive peptides; Degree of hydrolysis;α-glycosidase inhibition rate

中图分类号：TS254.9

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一种由于胰岛素生物作用受损或分泌不足而引起血液中葡萄糖水平慢性增高为特征的代谢疾病，持续的高血糖和长期代谢紊乱会导致人体出现肾脏、眼睛、足部、神经、心血管等组织器官受损的症状，严重时容易引发酮症酸中毒、高血糖高渗性昏迷等急性并发症。近年来，受生活水平提高、饮食结构改变、生活节奏加快、体力劳动强度降低以及少动多坐的生活方式等诸多因素的影响，全球糖尿病发病率不仅增长迅速，发病人群也日趋年轻化[1-3]。最新数据显示，我国是全球糖尿病患者人数最多的国家，患者人数1.14亿，约占全球糖尿病人总数的33%[4]。糖尿病目前尚无根治方法，最有效的方式是靠饮食、运动和药物联合控制血糖水平。应用最普遍、药效最明显的主要是胰岛素、磺酰脲类和双胍类降糖药物，但存在一定副作用[5]。

降血糖肽是一类能降低血糖的多肽活性物质，来源于食物蛋白，安全性高、无毒副作用，适合长期服用，除此之外，降血糖肽本身是一种多肽，具有较强的营养价值。无论在功能性食品还是在医药产品开发方面都具有广泛的应用前景[6-8]。

罗非鱼（Tilapia）也称福寿鱼、非洲鲫鱼，肉质厚、洁白无刺、味道鲜美，是联合国粮农组织极力推荐养殖的优良鱼种，在国际市场很受欢迎。罗非鱼加工主要是加工成鱼片、鱼条等，鱼头、尾、鳍、鳞、皮、内脏、残肉等沦为下脚料，总重量约占整鱼的60%[9-10]，

目前仅有部分被加工成鱼粉添加到饲料中，大部分被丢弃，造成蛋白资源的浪费。笔者曾以罗非鱼下脚料为原料制备过降血压肽[11]，本试验开展酶解制备降血糖肽的工艺研究，并对工艺进行优化，为罗非鱼下脚料的高值化综合利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

罗非鱼下脚料：新鲜罗非鱼洗净后剔除鱼肉，剩余物-20 ℃冻存，试验时4 ℃解冻;α-葡萄糖苷酶、对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：美国sigma公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

S-D200高效组织捣碎机，上海模具厂;UV-8000s紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限责任公司;Sigma 3-30k高速冷冻离心机，上海誉鑫科技有限公司;HDK-6数显恒温磁力搅拌水浴锅，常州德科仪器制造有限公司;RG-18磁力搅拌器，上海玛尼仪器设备有限公司;QDN-ll全自动凯氏定氮仪，杭州汇尔仪器设备有限公司;PB-10 pH计，德国赛多利斯科学仪器有限公司;SB5200DTD超声波清洗机，宁波新艺生物科技有限公司;AY220电子天平，日本岛津;UPN-11-10T超纯水制造系统，四川优普超纯科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白酶水解罗非鱼下脚料

将罗非鱼下脚料剪成小块，加水调节底物浓度，用高速组织捣碎机绞碎，调节所需pH，在设定温度下加酶水解一定时间，沸水浴灭活10 min，冷却后离心10 min，离心机转速3 500 r·min-1，中间部分的澄清液即为罗非鱼水解液。

1.3.2 蛋白酶的筛选

选取5种常用蛋白酶（碱性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶），结合生产厂家提供的最适酶解条件（表1所示），调节水解反应温度和pH，分别对罗非鱼下脚料进行水解，对比5种酶水解液的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率，筛选出最佳用酶。

1.3.3 酶解工艺优化

选择水解效果最佳的酶，在单因素试验的基础上，以温度、加酶量、底物浓度和pH4个因素，开展L16（45）正交试验，正交试验表见表2。

1.3.4 水解度测定的方法

水解度（DH）指蛋白质分子发生水解反应后断裂的肽键占蛋白质分子中总肽键的比例，反映蛋白质的水解程度。

（1）

式（1）中，氨基酸态氮（AAN）含量的测定参照GB 5009.235-2016中比色法;总氮含量的测定参照GB 5009.5-2016中凯氏定氮法。

1.3.5 α-葡萄糖苷酶抑制率测定方法[12-13]

取2 mg·mL-1蛋白酶水解液100 μL，加入0.16 U·mL-1

的α-葡萄葡萄葡萄糖苷酶溶液50 μL，于37 ℃水浴10 min后，加入2.5 mmol·L-1的底物PNPG（对硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷）溶液50 μL，在温度37 ℃条件下水浴15 min，随后立即加入1 mol·L-1的Na2CO3溶液100 μL终止反应，测定波长405 nm处的吸光度A1，另取100 μL磷酸盐缓冲溶液代替酶解液，测定其吸光度A0，再测定只有酶解液反应体系的吸光度A2，按式（2）计算抑制率：

（2）

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

5种蛋白酶分别在各自最适酶解条件下水解处理罗非鱼加工下脚料，水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率分析结果见图1。由图1可见，5种蛋白酶中对罗非鱼下脚料的水解能力较强的是胃蛋白酶和碱性蛋白酶，但胃蛋白酶水解液α-葡萄糖苷酶抑制率较低;胰蛋白酶水解能力相對较差，但水解液具有很强的α-葡萄糖苷酶抑制活性;木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率都比较差。由此可以看出，蛋白酶水解能力强弱与水解产物α-葡萄葡萄糖苷酶抑制活性无线性关系，分析原因可能是受蛋白酶的作用方式和作用位点影响，不同蛋白酶处理后罗非鱼下脚料水解液中蛋白多肽结构和长短不同，对α-葡萄葡萄糖苷酶的抑制活性不同。据此，比较5种不同蛋白酶水解效果，综合考虑水解度和α-葡萄葡萄糖苷酶抑制率两个指标，确定选取碱性蛋白酶为目标用酶。

2.2 试验条件优化

前期单因素试验结果表明：碱性蛋白酶水解罗非鱼加工下脚料的最佳温度为50 ℃，最佳加酶量为

10 000 U·g-1，最佳pH为9.5，最佳底物浓度为5%。据

此，以温度、加酶量、pH和底物浓度4个因素，以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率为指标，开展正交试验，试验结果及数据分析见表3、表4。从正交试验极差分析结果（表3）可知，影响水解度的因素主次顺序为：A>C>D>B，最优组合为A2B3C3D3，而影响抑制率的因素主次顺序为C>A>B>D，最优组合为A2B2C3D3。两个组合的差别仅在于因素B（加酶量）是取水平二还是水平三。从方差分析结果（表4）可知，因素A（温度）对水解度影响显著，因素B和因素D对水解度合抑制率均没有显著影响，且因素B对抑制率影响比对水解度影响强。因此，从经济角度考虑，将因素B的最适条件优化为B2，则碱性蛋白酶水解工艺的最适组合为A2B2C3D3，即温度50 ℃、加酶量10 000 U·g-1、pH 9.5、底物浓度6%。以最适组合条件进行验证试验，罗非鱼下脚料水解度为28.19%和30.12%。

3 结论

通过对比胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等5种常用蛋白酶水解罗非鱼下脚料的效果，确定碱性蛋白酶为目标用酶，该酶反应条件相对温和，实验条件易于控制，水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率相对较高。通过单因素和正交试验，对碱性蛋白酶水解罗非鱼下脚料制备降血糖肽的工艺条件进行了优化，最适条件是：温度50 ℃、加酶量10 000 U·g-1、pH9.5、底物浓度6%，此工艺条件下水解度与抑制率分别为28.19%和30.12%。

参考文献：

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基金项目：海南省重点研发计划专项（编号：ZDYF2018083）。

作者简介：赵 阔（1984—），女，硕士，高级工程师;研究方向为食品营养与健康。