胶结方式对微生物诱导碳酸钙沉积的影响

张海丽， 徐品品， 刘数华， 冷立健， 周文广

(1. 南昌大学 资源环境与化工学院 鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室， 南昌 330031； 2. 武汉大学 水资源与水电工程科学国家重点实验室， 武汉 430072)

传统的建筑胶凝材料主要包括硅酸盐水泥、石灰、石膏和水玻璃等[1]，其中硅酸盐水泥是目前用量最大的一种建筑材料，但由于其能耗较高，生产工艺较为复杂，污染较为严重，且在生产运输过程中容易产生引起环境污染的不利性因素，对人类的生活与健康有较大的危害[2]。因此，国内外许多学者尝试寻找一种新型环保的胶凝材料。近年来，微生物诱导碳酸钙沉积(Microbial induced calcium carbonate precipitation，MICP)作为一种新型环保胶凝技术逐渐被大众所熟知，微生物通过自身矿化作用诱导产生碳酸钙沉淀并能有效地将散粒材料胶结成具有一定强度和结构完整性的整体[3-4]。该技术具有能耗低、环境友好、反应过程简单等特点，已在岩土工程和环境工程中具有广泛的应用[5-6]。

早在2004年，Whiffin[7]就利用从土壤中分离出的芽孢杆菌进行微生物诱导碳酸钙沉积实验，与未进行生物固结砂体相比，生物胶结砂体的强度和刚度分别提高了8倍和3倍，该实验研究使微生物水泥的运用成为了可能。Sun等[8]研究了两种芽孢杆菌在不同温度条件下对微生物诱导碳酸钙的影响，低温条件下在培养基中添加尿素能提高钙沉淀率，使后续的低温诱导碳酸钙沉积技术成为可能。Zhang等[9-10]研究了不同钙源对MICP过程的影响，发现使用乙酸钙诱导沉积得到的砂柱有较好的物理性能，同时乙酸钙中的乙酸可以作为有机碳源为细菌提供营养物质。Omoregie等[11]研究了pH值、温度和尿素浓度对细菌脲酶活性的影响，发现在中温、pH碱性值和高尿素浓度下能获得高脲酶活性细菌。Dhami[12]和Al-salloum[13]等研究细菌种类、培养基种类和细菌浓度对生成的碳酸钙含量及晶型有一定影响，从而得到具有不同抗压强度的砂柱试样。

综上所述，尽管国内外学者研究了温度、钙源、脲酶活性、微生物种类及浓度对微生物诱导沉积过程的影响，但是很少考虑胶结方式对微生物诱导沉积过程影响的研究。因此，考虑微生物诱导碳酸钙沉积的成型工艺对微生物水泥的现场规模生产具有现实意义。本文研究了不同胶结方式对MICP过程的影响，实验从砂柱溶液的出水流速、pH值、脲酶活性、剩余尿素含量、碳酸钙含量和抗压强度等参数指标来表征胶结方式对诱导沉积过程的效果，为微生物水泥的生产和应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌液的培养

本实验选用的菌种为巴氏芽孢杆菌(Sporosarcinapasteurii)，购于美国菌种保藏中心(ATCC 6453)，经活化富集后再培养。为有利于菌种的新陈代谢和繁殖，确定本实验菌液的培养基成分及含量为：酵母膏20 g/L，硫酸铵10 g/L。并将培养基置于121 ℃状态下灭菌20 min。细菌培养温度稳定为30 ℃，振荡床转速调至150 r/min，细菌振荡培养24～36 h，当细菌培养到OD600为0.8～1.0进行实验。

1.1.2 胶结溶液

为了提供微生物诱导碳酸钙沉积过程所需的钙离子和尿素，需配制一定浓度的胶结液。本实验胶结溶液是由乙酸钙和尿素按1∶1比例混合而成的溶液，乙酸钙和尿素浓度分别为0.3 mol/L。

1.1.3 实验用砂

本实验所用砂为粒径在0.15～0.3 mm的细粒砂，砂粒中二氧化硅含量为98%，经筛分实验后，砂粒的颗粒级配曲线绘制如图1所示。

1.2 方法

本实验选用模具为50 mL的针筒，经MICP实验胶结后所得砂柱直径25 mm，高40 mm。将装备好的砂柱用去离子水反复冲洗3次，以去除砂颗粒间的气泡。

1.2.1 连续运行胶结方式

连续运行胶结采用流动速度为1.0 mL/min的蠕动泵将恒温振荡培养箱中20 mL菌液注入砂柱中，出水口用50 mL烧杯收集溶液，再将烧杯中溶液通过蠕动泵不断注入砂柱；12 h后将20 mL胶结液注入砂柱中，反应时间为12 h；以此为一个连续运行周期，实验共进行14个周期。对照实验选用不添加菌液，以去离子水代替菌液进行胶结，其他条件与实验组相同，每组实验3个平行样。

图1 实验用砂级配曲线

1.2.2 间断运行胶结方式

间断运行胶结是将恒温培养箱中20 mL菌液通过流动速度为1.0 mL/min的蠕动泵注入砂柱中，待菌液完全注入砂柱后将出水口封堵；12 h后，将菌液排出并注入20 mL胶结液于砂柱中，再将出水口封堵，反应时间为12 h；以此为一个连续运行周期，实验进行14个周期。对照实验选用不添加菌液，以去离子水代替菌液进行胶结，其他条件与实验组相同，每组实验3个平行样。

1.2.3 参数测定

收集砂柱中的流出液并测定其7个连续周期的pH值、电导率、脲酶活性、剩余尿素浓度和砂柱的出水流速。pH值是通过pH计测得。脲酶活性是通过测定1 mL菌液和9 mL 1.1 mol/L的尿素在5 min内电导率的变化率，再乘以10的稀释倍数所得到[7]。尿素浓度则是通过比色法来测定，将4 mL试样与2 mL 4%的对二甲基苯氨基和4%的硫酸乙醇溶液混合均匀，显色10 min后，在422 nm处测定其吸光度[14]。而通过收集流出砂柱的液体体积，再除以相应的流出时间，以此来计算砂柱出水的流速[15]。

砂柱胶结完成后，用去离子水充分冲洗砂柱，而后将其放入恒温干燥箱进行烘干处理(烘烤温度60 ℃，烘干时间为72 h)，待其脱模后，测定不同砂柱位置的碳酸钙含量及砂柱抗压强度，XRD和SEM。为定量获取MICP实验生成的碳酸钙质量，对砂柱施加过量的盐酸，经1 h充分反应后，用去离子水反复冲洗试样3次，再置于恒温干燥箱中经105 ℃烘干，试样酸洗前后的质量差即为碳酸钙含量。通过使用万能拉力试验机(HD-B609B-S)对砂柱进行抗压强度测试，加载为1 mm/min。XRD是通过使用X射线衍射仪(Bruker D8 ADVANCE)测定。SEM是通过使用场发射扫描电镜(JSM-6701F)测定。

2 结果与讨论

2.1 pH值对细菌生长活性的影响

为获得芽孢杆菌新陈代谢和繁殖的最佳pH值，以保证MICP胶结砂柱实验的有效进行。在进行胶结实验前，预先探讨pH值对细菌生长活性的影响，实验分别绘制了pH值为7、8、9、10这4个不同pH值梯度的细菌生长曲线及其脲酶活性曲线。结果图2和图3表明：细菌在pH值为8时，细菌生长得到最大促进，培养48 h后细菌浓度和脲酶活性达到最佳状态，在pH值为10时，细菌生长受到显著抑制。

图 2 不同pH值细菌生长曲线

图 3 不同pH值细菌脲酶活性

表1为细菌在不同pH值条件下达到的最大OD600和脲酶活性。当pH值为8时，实验所培养的细菌生长处于最佳状态，测得OD600最高可达0.946，脲酶活性可达602 us/(cm·min)；而当pH值为10时，过高的碱性环境显著的抑制了细菌生长，脲酶活性最大只有52 us/(cm·min)。因此，本实验芽孢杆菌适合在碱性环境生长，但当细菌生长环境的pH值超过10时，其生长会受到显著的抑制。

表 1 细菌在不同pH值条件下达到的最大OD600和脲酶活性

2.2 不同胶结方式对砂柱出水流速的影响

为了表征经MICP试验后砂柱内部孔隙的填充效果，实验分别测定了两种胶结方式下7个连续周期时间砂柱的出水流速，图4给出了连续运行和间断运行两种胶结方式下砂柱的出水流速随实验周期的变化规律。砂柱的初始流速经测定为46.15 mL/min，砂柱胶结一个周期后，连续运行胶结的砂柱出水流速变为了18.75 mL/min，流速降低了59.37%，而采用间断运行胶结的砂柱的出水流速为30.12 mL/min，流速降低了34.73%。在连续胶结7个周期后，连续运行胶结砂柱的出水流速降至0.12 mL/min，而间断运行胶结砂柱的出水流速降至0.74 mL/min。两种胶结方式的砂柱出水流速都降低了98%以上，这也进一步说明了微生物诱导碳酸钙沉淀具有显著的胶结作用并且可以有效封堵砂粒间的空隙，从而降低砂柱的孔隙率。另外由图4可以清晰地看出，经连续运行胶结下砂柱的出水速度小于同一时间下经间断运行胶结下砂柱的出水速度，表明在连续运行胶结方式下的孔隙填充效果优于经间断运行胶结下的孔隙填充效果。主要是由于在连续运行胶结方式下增大了菌液、胶结液和砂粒之间的接触面积，使得经MICP试验后持续生成的碳酸钙沉淀黏结在砂粒表面，从而减少了砂柱的孔隙率，降低了砂柱的出水流速。

图 4 不同胶结方式砂柱的出水流速

2.3 不同胶结方式砂柱出水的pH值和脲酶活性变化

图5和图6分别给出了不同胶结方式下砂柱的出水pH值和脲酶活性随实验周期的变化规律。由图5可以看出，在整个实验过程中，砂柱的出水pH值都在8.1～8.6范围内，而对照实验组工况下的砂柱pH值都维持在7.8～8.0范围内，明显可以看出实验组工况下砂柱的出水pH值都大于对照实验组工况下砂柱的出水pH值，这也进一步说明了细菌在新陈代谢活动过程中产生大量高活性脲酶将尿素水解成碳酸根离子和铵根离子，从而产生了碱性环境，使得砂柱的出水pH值逐渐升高[16]，而对照实验组中未添加细菌，故溶液中不含有可以将尿素水解成碳酸根离子和铵根离子的高活性脲酶，因此环境pH未发生明显变化。

由图6可知，砂柱出水的脲酶活性随着胶结周期数的增加而逐渐下降，对照实验组砂柱未添加细菌，因此脲酶活性为零，图中未给出对照实验组的脲酶活性曲线。砂柱出水的脲酶活性逐渐降低，主要有两个原因，其一是细菌作为成核位点，被形成的碳酸钙沉淀包裹而死亡[17]，导致细菌浓度降低，脲酶活性也随之降低。其二是在MICP过程中，砂柱孔隙减少，营养物质不能运输到细菌，使得细菌生长受到抑制，脲酶活性下降。而连续运行胶结的细菌脲酶活性高于间断运行胶结的细菌，表明连续运行胶结方式的细菌生长优于间断运行胶结方式的细菌生长，最后由于砂柱孔隙逐渐减少，两种胶结方式的细菌脲酶活性无显著差别。

图 5 不同胶结方式的砂柱出水pH值

图 6 不同胶结方式砂柱出水的脲酶活性

2.4 不同胶结方式砂柱出水的剩余尿素浓度

图7给出了不同胶结方式下砂柱出水剩余尿素浓度随实验周期的变化规律。由图7可知，在实验前期，砂柱出水的剩余尿素浓度较高，尿素利用率保持在58%范围内，实验连续进行5个胶结周期后，砂柱出水的剩余尿素浓度显著降低，尿素的利用率在90%以上，随着胶结周期数的增加，剩余尿素浓度也呈现增加的趋势，主要是由于在砂柱胶结初期，砂颗粒间的孔隙较大，细菌细胞不易吸附在砂颗粒表面，MICP过程缓慢；随着胶结周期数的增加，细菌细胞能大量吸附在砂颗粒孔隙之间，细菌细胞分泌的脲酶能迅速水解尿素，产生的碳酸根与钙离子结合并生成碳酸钙沉淀，导致砂柱孔隙率显著降低，造成细菌生长环境变得恶劣并使得细菌活性降低，因此砂柱出水的剩余尿素浓度开始增加。由图7可以清晰地看出经连续运行胶结下砂柱出水的剩余尿素浓度小于同一时间下经间断运行胶结下砂柱出水的剩余尿素浓度，主要是由于连续运行胶结砂柱中的胶结液能不断在砂颗粒间连续运行，从而使细菌水解尿素持续进行，导致胶结液中尿素降低，尿素的利用率较高，而间断运行胶结砂柱中的胶结液未能持续与砂颗粒间的细菌接触，从而使尿素利用率低，砂柱出水的剩余尿素浓度较高。

2.5 不同胶结方式的砂柱碳酸钙含量及抗压强度

连续运行砂柱体和间断运行砂柱体不同部位的碳酸钙含量变化规律结果(图8)显示，砂柱在的不同部位碳酸钙含量存在明显差异，其中上部的碳酸钙含量最多，中部次之，下部最少。其中，两种胶结方式得到的砂柱体的碳酸钙含量在上部时无显著差别，分别为28%和26%。但是，其下部的碳酸钙含量差异比较明显，连续运行胶结的砂柱下部的碳酸钙含量比间断运行胶结砂柱下部的碳酸钙含量高2倍多。图 9为砂柱试样的实物图，a为连续运行胶结试样，b为间断运行胶结试样。连续运行胶结得到的砂柱抗压强度可达6.32 kPa，间断运行胶结得到的砂柱的抗压强度可达3.67 kPa。结合图 8和图 9，连续运行胶结方式下得到一个完整的砂柱，间断运行胶结方式下得到一个局部砂柱。两种胶结方式得到的砂柱试样差异明显，主要由于间断运行胶结砂柱上部诱导沉积效果显著，砂粒间的孔隙显著降低，导致胶结液和菌液被截留在砂柱上表面，下部的砂柱不能有效地进行MICP过程且生成的碳酸钙含量较低。而连续运行胶结砂柱的胶结液和菌液都是贯通在整个砂柱中，使得整个试样能有效进行MICP过程。

图 7 不同胶结方式的砂柱出水剩余尿素浓度

图 8 不同部位砂柱的碳酸钙含量

2.6 XRD和SEM分析

图 10为砂柱的XRD图谱，SiO2为砂的主要成分，方解石(CaCO3)为MICP过程的产物。图 11为砂柱的SEM图像，a为100倍电镜下砂颗粒的图，b为4000倍电镜下砂颗粒的图。在图 11-a中，砂颗粒之间被紧紧胶结在一起，并堆积在砂粒间；图11-b能看到砂表面包裹的方解石和杆状细菌，还能看到碳酸钙表面的小孔，这是细菌作为成核位点遗留下来的痕迹，它能作为黏结砂颗粒的桥梁并在诱导沉积中起着关键的作用[18]。结合图 10和图 11，表明砂柱是由方解石胶结松散颗粒而成。

图 9 砂柱胶结实物图(a)连续运行胶结砂柱试样(b)间断运行胶结砂柱试样

图10 砂柱矿物的XRD图谱

图11 砂柱矿物的SEM图像(a为100倍；b为4000倍)

3 结论

1)微生物诱导碳酸钙沉积可以有效地胶结砂粒，而微生物在MICP实验过程中扮演着至关重要的作用。当pH为8时，细菌的生长条件达到最佳状态，且高活性的芽孢杆菌能使MICP实验更有效率。

2)微生物诱导碳酸钙沉淀具有显著的砂粒胶结作用并可有效地封堵砂柱间的孔隙，从而降低砂柱的孔隙率。但经连续运行胶结下砂柱的出水速度小于同一时间下经间断运行胶结砂柱的出水速度，连续运行胶结方式下砂柱的孔隙封堵效果较好，得到的砂柱性能较好。

3)两种胶结方式得到的砂柱碳酸钙含量存在明显的差异，连续运行胶结方式下不同部位的碳酸钙含量都高于相应部位下间断运行胶结的碳酸钙含量，且不同部位的碳酸钙含量也存有差异。对于间断运行胶结方式形成的砂柱，其砂柱局部性胶结，但对于连续运行胶结方式形成的砂柱，虽然砂柱的不同部位碳酸钙含量也存有差异，但不影响试样表面整体性。