芦荟大黄素对铜绿微囊藻的化感抑制作用研究

赵红艳, 王 娇, 曹井国, 杨宗政, 刘红磊

(1. 天津科技大学 化工与材料学院， 天津 300457； 2. 天津科技大学 海洋与环境学院， 天津 300457； 3. 天津市环境保护科学研究院， 天津 300191)

由于水体富营养化，蓝藻水华导致严重的环境问题，引起了世界的广泛关注[1]。蓝藻水华过程中伴随着有机物厌氧分解，产生难闻的气味，并使水体水质变差[2]。一些蓝藻还会释放出蓝藻毒素，危胁水生生物和人类的健康[3]。控制蓝藻水华已经成为环境保护迫切需要解决的问题[1]。

近几年，采用化感物质作为杀藻剂已经引起广泛关注[4]，化感物质已被证实是一种环境友好性的杀藻剂，它具有特异性和生物可降解性[5]。人们相继开展了化感抑藻研究，比如水稻提取物对铜绿微囊藻生长的抑制作用研究[6]，大麦秸秆对蓝藻化感作用与机理的研究[7]，臭椿提取物对铜绿微囊藻的抑制作用研究[8]，胡桃醌以及衍生物对铜绿微囊藻的抑制作用研究等[9]。中药是化感物质的资源宝库，富含众多化感成分，对中药提取物抑藻研究也呈逐年增多的趋势[10]。

大黄化学成分包括蒽醌类、吡喃酮类、苯丁酮类、萘苷类、酰基糖苷类、二苯乙烯类、鞣质前体及鞣质等，其中蒽醌类成分是大黄中一类重要活性成分，研究发现其有抗炎、抗肿瘤、保护心血管等广泛的药理作用[11-12]。大黄的化学成分比较复杂，本课题组在前期研究发现，中药大黄提取物具有显著抑藻效果。中药大黄提取物对藻类具有抑制作用的可能为大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚和芦荟大黄素等蒽醌类化合物[13]。

本文选用芦荟大黄素作为抑藻剂，研究其对细胞结构、光合系统、蛋白合成以及藻毒素的影响，揭示芦荟大黄素抑制蓝藻效果与机制，为进一步对大黄有效化感物质的鉴别和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 藻类的培养

藻类的培养参考文献[14]。芦荟大黄素购于四川省维克奇生物科技有限公司。

1.2 实验方法

将5 mL的浓度为50～200 mg/L芦荟大黄素的标品分别加入到150 mL铜绿微囊藻培养液(藻液初始浓度约为107cells/mL)中(对照组加入相同体积的DMSO溶液)，且每组设置3个平行样。记录藻液的初始密度和OD值(OD=680,紫外可见分光光度计，UV-2700)，每72 h测定1次。叶绿素a、类葫芦卜素、藻胆蛋白和藻毒素的测定方法参照文献[14]；可溶性蛋白的测定方法参照文献[15]。

1.3 电镜(SEM)

将细胞用5%的戊二醛固定2 h，用pH 7的磷酸缓冲溶液洗涤3次，用20%～100%的乙醇脱水，用叔丁醇置换样品3 次，再用冷冻干燥机干燥12 h，镀金。用扫描电镜(SEM，SU1510)在30 kV下观察铜绿微囊藻细胞显微结构的变化。

1.4 丙二醛、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的测定

丙二醛(MDA)含量通过硫代巴比内酸比色法测定参考文献[16]。超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化氢按照试剂盒的说明进行测定。

1.5 统计分析

统计分析方法参见文献[14]。

芦荟大黄素对铜绿微囊藻生长抑制率(IR)的计算公式如下：

IR(%)=(1-En/Cn)×100%

式中，En表示第n天实验组的藻密度；Cn表示第n天对照组的藻密度。

2 结果与讨论

2.1 对铜绿微囊藻生长的影响

芦荟大黄素对铜绿微囊藻生长的影响如图1所示，可见芦荟大黄素对铜绿微囊藻细胞的生长均有抑制作用。与对照组相比，随着浓度的增加和时间的延长，实验组中OD值持续降低。各组培养液初始OD约为1.08，至12 d时，对照组中藻液的OD值为1.44；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L，藻液中的OD值分别为1.223、0.337和0.299；抑制率分别为15%、80%和90%。

图1 芦荟大黄素对铜绿微囊藻生长的影响

a：对照组；b、c和d： 50、100和200 mg/L

对12 d的藻细胞分别进行扫描电镜观察，结果(图2)显示，正常藻细胞表面光滑，颗粒分布均匀，细胞接近球形。芦荟大黄素浓度为50 mg/L时，大多数藻细胞通常是圆形的并且外部光滑，但是有的细胞出现褶皱，周围分布着絮状物(图2-b)；芦荟大黄素浓度为100和200 mg/L时，大多数的细胞形态不完整，细胞出现空洞，表面和周围被内溶物覆盖(图2-c、d)。这可能是由于化感物质使细胞膜的通透性发生改变，细胞的内含物大量渗出，甚至细胞膜整体破裂、溶解[17]，导致死亡。

2.2 对铜绿微囊藻中丙二醛含量的影响

分解产物MDA常被用作评估细胞氧化损伤的生物指标[18]。测定MDA的积累可以反映机体胁迫损伤程度，特别是膜结构的破坏程度[19]。铜绿微囊藻中MDA含量的变化结果(图3)显示，芦荟大黄素能有效抑制铜绿微囊藻的生长。随着浓度的增加和时间的延长，实验组中的MDA含量显著增加。至12 d时，对照组中MDA的含量为0.0506 mg/L；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时，MDA的含量分别为0.0822、0.1122和0.1198 mg/L，与对照组相比，分别为是对照组的1.6倍、2.2倍和2.4倍。而对照组的MDA的含量保持相对稳定。由此可见，经不同浓度芦荟大黄素处理的铜绿微囊藻细胞内MDA的含量明显增加，加剧了藻细胞的膜脂过氧化反应，使细胞损伤严重，抑制了铜绿微囊藻的生长。

图3 芦荟大黄素对铜绿微囊藻MDA含量的影响

2.3 对铜绿微囊藻光合系统的影响

芦荟大黄素对叶绿素a和类胡萝卜素的影响分别如图4-A、B所示。

由图4-A可知，至12 d时，对照组中的叶绿素a的含量为4.867 mg/L；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时，叶绿素a的含量分别为4.11、1.600和1.097 mg/L；抑制率分别为16%、67%和78%。由此可知，芦荟大黄素浓度越大，对铜绿微囊藻中叶绿素a的抑制作用也越大。

A:叶绿素a；B:类胡萝卜素

由图4-B可知，至12 d时，对照组中的类胡萝卜素的含量为1.083 mg/L；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时，类胡萝卜素的含量分别为0.822、0.176和0.111 mg/L，抑制率分别为24%、84%和90%。由此可知，芦荟大黄素浓度越高，对铜绿微囊藻中的类胡萝卜素的抑制作用也越大。

叶绿素含量是光合速率测定中不可缺少的指标，在光合作用过程中起着能量捕获和转移的重要作用[20]，叶绿素a是铜绿微囊藻中最主要的光合色素，也可以作为铜绿微囊藻中光合作用能力的监测因子[21]，类胡萝卜素具有吸收和传递光能的作用[22]。上述实验说明，芦荟大黄素破坏了藻细胞内的光合色素叶绿素a和类胡萝卜素，这与以前的研究结果一致[21]。本实验中的叶绿素a和类胡萝卜素的降低可以证明芦荟大黄素对铜绿微囊藻的光合作用的抑制作用，进一步导致铜绿微囊藻细胞的正常生理代谢功能障碍。

A：藻蓝蛋白；B：别藻蓝蛋白；C：藻红蛋白

藻胆蛋白是光合系统中重要的组成部分，具有吸收和传递能量的作用，芦荟大黄素对藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、藻红蛋白的影响分别如图5所示。

由图5-A可知，至12 d时，对照组中的藻蓝蛋白的含量为0.033 58 mg/L；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时，藻蓝蛋白的含量分别为0.027 49、0.000 80和0 mg/L；抑制率分别为20%、98%和100%。由此可知芦荟大黄素浓度越高，对铜绿微囊藻中藻蓝蛋白的抑制作用也越大。

由图5-B可知，至12 d时，对照组中的别藻蓝蛋白的含量为0.0161 mg/L，芦荟大黄素浓度为50、100和200 mg/L时，别藻蓝蛋白的含量分别为0.0120、0.0013和0.0009 mg/L，抑制率分别为25%、92%和95%。由此可知芦荟大黄素浓度越高，对铜绿微囊藻中的别藻蓝蛋白抑制作用也越大。

由图5-C可知，至12 d时，对照组中的别藻蓝蛋白的含量为0.0430 mg/L；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时，藻红蛋白的含量分别为0.0360、0.0076和0.0048 mg/L；抑制率分别为17%、83%和89%。由此可知芦荟大黄素浓度越高，对铜绿微囊藻中的藻红蛋白抑制作用也越大。

藻胆体作为捕获光能的功能单位，由藻胆蛋白(藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蛋白)及连接蛋白构成，排布在光合膜的表面，可以吸收460～670 nm波长范围的光，将吸收的能量传到光合反应膜上进行光合作用。藻胆蛋白负责吸收光能，连接蛋白通过调整其组装结构及属性，使能量传递达到最佳[23]，即光合系统Ⅱ(PSⅡ)，这3种藻胆蛋白是蓝藻光合作用的主要功能团[24]。藻胆蛋白含量的减少，导致铜绿微囊藻吸收的能量传递给叶绿素a时受阻，从而导致光合作用捕光能力下降，进而抑制了藻类的光合作用[25]。结果表明：芦荟大黄素破坏了光合作用中藻胆蛋白的结构，使光合速率降低，进而抑制藻胆蛋白的产生，会导致捕获和吸收光的能力下降，抑制光合系统Ⅱ(SPⅡ)的活性。

2.4 对铜绿微囊藻中可溶性蛋白的影响

蛋白质是藻细胞生命活动的主要承担者，细胞内可溶性蛋白含量往往与细胞的代谢强度直接有关[5]。可溶性蛋白含量是藻细胞生理代谢功能的重要指标[26]。芦荟大黄素对可溶性蛋白的影响结果(图6)显示，芦荟大黄素对铜绿微囊藻细胞中可溶性蛋白含量有抑制作用。与对照组相比，随着浓度的增加和时间的延长，实验组中可溶性蛋白含量持续降低。由图6还可知，处理至12 d时，对照组中的可溶性蛋白的含量为110.2 mg/L；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时，可溶性蛋白的含量分别为89.1、39.3和30.5 mg/L；抑制率分别为20%、65%和73%。

图6 芦荟大黄素对铜绿微囊藻可溶性蛋白含量的影响

2.5 对铜绿微囊藻中超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的影响

Alexova等[27]提出了铜绿微囊藻具有防御功能的酶系统，包括SOD、CAT和其它酶，通过消除过多的活性氧来保护细胞免受氧化损伤。芦荟大黄素对铜绿微囊藻中SOD和CAT酶活性的影响如图7所示。

A:SOD；B:CAT

由图7-A可知，用芦荟大黄素处理至12 d时，对照组中的SOD的含量为0.005 14 U/104cells；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时， SOD的活性分别为0.004 07、0.003 91和0.002 96 U/104cells，抑制率分别为23%、42%和62%。

由图7-B可知，处理至12 d时，对照组中的CAT的含量为0.002 87 U/104cells；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时，CAT的活性分别为0.002 62、0.002 32和0.001 94 U/104cells，抑制率分别为10%、20%和33%。

2.6 对铜绿微囊藻藻毒素的影响

当细胞壁被破坏时，藻毒素可能会从微囊藻中释放[28]。藻毒素对生态及人体健康有害[29]。为了评估铜绿微囊藻细胞中的藻毒素释放和毒素的降解，分析了芦荟大黄素对铜绿微囊藻中的影响结果(图8)显示，芦荟大黄素对铜绿微囊藻细胞中藻毒素含量有抑制作用，这与之前的实验结果一致[16]。与对照组相比，随着暴露浓度和时间的延长，实验组中藻毒素含量持续降低。由图8还可知，在第9天时，对照组中的藻毒素的含量为1.0700 mg/L；芦荟大黄素浓度分别为50、100和200 mg/L时，藻毒素含量分别为0.889、0和0 mg/L；抑制率分别为17%、100%和100%。这表明芦荟大黄素在抑制藻细胞生长的同时也可以抑制和降解藻毒素。

图8 芦荟大黄素对铜绿微囊藻中藻毒素的影响

3 结论

本研究表明芦荟大黄素对铜绿微囊藻的生长具有很好的抑制作用，芦荟大黄素对细胞膜产生伤害，引起铜绿微囊藻细胞内MDA 的含量显著增加，造成藻细胞膜系统和功能紊乱；抑制铜绿微囊藻的叶绿素a等光合色素，阻遏其对光的捕获及吸收，扰乱藻胆蛋白各组分的合成，从而降低铜绿微囊藻的光合作用；芦荟大黄素也影响可溶性蛋白的合成，从而间接导致藻细胞正常生理代谢功能紊乱；芦荟大黄素可以减轻或削弱抗氧化系酶( SOD、CAT) 的活性，进而造成细胞的氧化损伤；芦荟大黄素能显著抑制藻毒素的产生，降低藻毒素的次生风险。本研究为寻找蓝藻水华的有效化感制剂提供了新的来源。