硬脑膜封合医用胶浸提液制备条件的研究*

董芳芳，苑康见，邓凤娟，赵艳，张尚，李正强，孔凡照，赵成如

(1.赛克赛斯生物科技股份有限公司，济南 250101；2.山东体内植入材料工程技术研究中心，济南 250101)

1 引 言

医疗器械浸提的目的是提供适宜的试验样品，以测定生物系统中可溶出物的生物学反应，从而验证可溶出物的潜在危害，用于可溶出物健康风险性评价。当制备器械浸提液时，所用的浸提介质和浸提条件应该既与最终产品的性质和用途相适应，又要与试验方法的可预见性(如试验目的、原理、敏感性等)相适应。因此，理想的浸提条件和试验系统浸提液的应用既要反映产品的实际使用条件，还要反映试验的目的和预测性[1-5]。

硬脑膜封合医用胶是一种用于防止脑脊液渗漏的生物水凝胶产品，用于在神经外科术中对硬脑膜进行辅助机械密封[6-7]。 该产品以粉剂聚乙二醇-N羟基丁二酰亚胺-戊二酸酯(分子量为20 000)与水溶性三赖氨酸/聚乙烯亚胺发生交联反应，喷涂创面后几秒内迅速聚合形成具有空间立体网状结构的粘性水凝胶，可快速封合硬脑膜缝合部位，以达到水密封合的效果[8-10]。

本研究以硬脑膜封合医用胶为研究对象，选用GB T 14233.1标准推荐的两种浸提比例，以及ISO10993-12(即GB T 16886.12)中推荐的5种浸提条件下制备浸提液。采用红外光谱(FTIR)、差示扫描量热(DSC)、pH值、渗透压、紫外光谱、液相色谱(HPLC)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行分析[11-14]。

2 材料与方法

2.1 仪器

pH测定仪，PHS-3D，上海精密科技有限公司；紫外分光光度仪，UV-2450，岛津(中国)有限公司；生化培养箱，LRH-150，上海一恒科技有限公司；分析天平，ML204，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；渗透压仪，OM815，德国罗泽公司；液相色谱仪，Aglient1200，美国安捷伦(中国)公司；电感耦合等离子体质谱仪，6300，美国热电公司；冷冻干燥机，VFD-2000，北京博医康实验仪器有限公司；傅立叶变换红外-近红外光谱仪，spectrum400，美国珀金埃尔默；DSC-SP差示扫描量热分析仪，Rheometric Scientific Inc.；高压蒸汽灭菌器，LS-B75L，江阴滨江医疗设备厂。

2.2 药品与试剂

硬脑膜封合医用胶，5 mL/支，赛克赛斯生物科技股份有限公司；氯化钠注射液，0.9%，山东华鲁制药有限公司；棉籽油，北京百灵威科技有限公司。

2.3 试验条件

根据GB T 14233.1∶2008以及ISO10993-12∶2007(即GB T 16886.12∶2005)的推荐，浸提介质为生理盐水和棉籽油。浸提比例为0.1和0.2 g/mL。浸提条件分别为(37±1)℃，(24±2) h；(37±1)℃，(72±2) h；(50±2)℃，(72±2) h；(70±2)℃，(24±2) h；(121±2)℃，(1±0.1) h。

2.4 冻干样品的制备

将医用胶以及浸提后的医用胶放入冷冻干燥机中冻干，在-40℃条件下预冻0.5 h，然后抽真空进行升华，约56 h后收料，得到医用胶冻干样品。

2.5 检测方法设计

为研究不同浸提条件对硬脑膜封合医用胶的浸提影响，我们将冻干样品和浸提液分别进行不同指标检测。对冻干样品进行差示扫描量热(DSC)、红外光谱、pH值、渗透压、紫外光谱指标检测，对浸提液进行液相色谱、电感耦合等离子体质谱指标检测，见表1。

表1 检测信息汇总

3 结果

依据2.5节的检测方法，采用红外光谱、DSC、pH值、渗透压、紫外光谱、液相色谱、电感耦合等离子体质谱对硬脑膜封合医用胶进行分析，实验结果见表2。

3.1 差示扫描量热

DSC扫描过程中，样品发生了放热行为，放热峰值(TC)均在50℃～60℃之间，见图1。样品浸提前后DSC具体结果数据见表3。放热峰值(TC)数据略有不同，说明凝胶及浸提后冻干凝胶到达物态转变点温度略有不同，可能与凝胶化学键断裂位置不同引起。纵坐标热流率变小，分析很可能是温度高对材料造成改变，样品中有效成分变少，相对热流率变小。

表2 实验结果汇总

图1 浸提样品DSC谱图

表3 不同样品浸提前后DSC结果

3.2 红外光谱分析

样品红外光谱图有一定的差异，最为明显在化学位移1 640～1 660 cm-1处，见图2。随浸提温度升高，吸收峰逐渐变弱，是由于该处为酰胺键中羰基-C=0的特征伸缩振动吸收峰，PEI和三赖氨酸中的伯氨或仲氨与NHS活化后的羧基发生反应形成了酰胺键。

图2 生理盐水浸提后的冻干凝胶的红外光谱图

3.3 生理盐水pH值

浸提液pH值变化呈下降趋势， 且pH值变化范围在7.90～6.40之间，见图3(a)。引起该结果的原因为，凝胶在浸提液中发生了降解，降解产物中的PEG呈中性，聚乙烯亚胺(PEI)虽然在水溶液中呈碱性(pH值：10.0～12.0)但含量较少，以酸盐形式存在的三赖氨酸导致溶液偏酸性，且三赖氨酸的含量大于聚乙烯亚胺，三赖氨酸从凝胶中游离出来后导致浸提液pH值降低。

3.4 生理盐水渗透压

0.1与0.2 g/mL的浸提液渗透压数值均逐渐升高，且0.2 g/mL的浸提液渗透压远高于0.1 g/mL浸提液的，渗透压变化范围为275～310 mosm，见图3(b)。引起该结果的原因可能是凝胶中的三赖氨酸在溶液中以离子形式(NH+、COOH-)存在，使浸提液中离子浓度偏高，导致渗透压逐渐升高。渗透压偏高可能会影响部分生物学指标的检测结果，如皮内反应，溶血率等，由上述数据可知，0.1 g/mL的浸提液更适用于生物学评价。

图3 不同条件下生理盐水浸提液pH和渗透压变化趋势

3.5 紫外光谱分析

三赖氨酸的吸收峰为260 nm，随着浸提温度升高，多肽三赖氨酸可能会有一定失活或分解，故吸收峰逐渐减弱，见图4(a)。失活或分解的三赖氨酸仍含有酸盐，故与3.3生理盐水pH值检测结果不矛盾。

在630 nm处有微弱吸收峰，此处为N-羟基丁二酰亚胺的吸收峰。由于N-羟基丁二酰亚胺溶于溶液中会很快开环，不受浸提温度的影响随温度变化，故该吸收峰变化不大。

在棉籽油浸提液中有一定吸光度的杂峰，但不同温度和浸提比例，吸收变化差异不大，说明浸提液内为棉籽油自身物质，而凝胶中大部分为水溶性物质，故未从棉籽油中浸提出，见图4(b)。

图4 生理盐水浸提液和棉籽油浸提液的紫外光谱图

图5 生理盐水浸提液的液相色谱图

3.6 液相色谱分析

2.8 min处为PEG的峰，2.2 min处为杂质峰，随着浸提温度升高，样品峰面积变化不大，而2.2 min的杂质峰面积略有增加。说明PEG中的-CH2-CH2-结构较为稳定，温度较高也未引起含量的降低。2.2 min处的杂质峰可能由凝胶中物质或浸提液高温引起，见图5。

3.7 电感耦合等离子体质谱分析

不同浸提温度和浸提比例，以生理盐水或棉籽油作为浸提液，浸提液中重金属总含量均无明显差异，仅比空白液略高。说明由材料中溶出的重金属含量不高，见图6。

图6 不同条件浸提液重金属含量

4 结论

本研究通过不同浸提条件对硬脑膜封合医用胶产品进行浸提，并对其理化指标进行分析，通过红外光谱、差示扫描量热、液相色谱、电感耦合等离子体质谱等检测，结果显示不具有等效性，随着浸提温度的升高，材料降解情况明显，尤其是紫外检测显示(121±2)℃，(1±0.1) h下三赖氨酸吸收峰几乎消失，对产品影响较大。参考GB T16886.12的附录C.5“浸提不应使材料发生明显降解”的要求，本产品的浸提条件应该选择较低的温度，因此，优选浸提温度为(37±1)℃。

在(37±1)℃条件下，由实验数据可知，(24±2) h和(72±2) h两个浸提时间下，各项数据差异不大。但参考GB T 16886.12的附录C.5 “植入器械如仅在盐水中(37±1) ℃浸提(24±2)h是很难被接受的”，最终优选浸提时间为(72±2) h。由于本研究于2017年初设计，参考标准为GB T 16886.12-2005推荐的5个浸提条件，GB T 16886.12-2017执行后将浸提条件改为4个，删除浸提条件(37±1)℃，(24±2)h，也说明该条件的不适宜性。

由于渗透压检测指标显示0.2 g/mL浸提造成离子浓度大，渗透压偏高，因此，本研究浸提比例选择0.1 g/mL。综上，本研究硬脑膜封合医用胶浸提液的制备条件为0.1 g/mL， (37±1)℃，(72±2) h。