艾拉莫德联合MAPK通路抑制剂对类风湿关节炎大鼠的治疗作用

秦理 杨孝兵 刘丽敏 龙小琴 邵丰

类风湿关节炎是一种以滑膜炎症和关节破坏为主要表现的慢性自身免疫性疾病。该病多发于手、足、腕等关节，呈对称分布且易反复发作。类风湿关节炎患者的软骨、关节骨等处可见侵袭性破坏且呈不可逆转性，严重者出现关节强直、畸形，甚至丧失关节功能[1-2]。目前，仍有部分类风湿关节炎患者经多种抗风湿药物联合治疗6个月以上仍未缓解的情况[3]。因此，寻找合适的类风湿关节炎治疗方案是临床中亟需解决的问题。艾拉莫德是用于成人类风湿关节炎的一类新药，在减轻炎症反应、缓解临床症状等方面具有重要作用[4-5]，但对难治性类风湿关节炎效果仍不满意。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路在类风湿关节炎的发生、发展中具有重要作用[6-7]。Pan等[8]发现阻断MAPK通路的激活，能够抑制类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞的迁移与侵袭，有助于减轻类风湿关节炎的严重程度。本研究通过建立类风湿关节炎大鼠模型，探讨艾拉莫德联合MAPK通路抑制剂p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂1（p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor 1，p38 MAPK-IN-1）的治疗作用，以期为类风湿关节炎的治疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 药物与试剂 艾拉莫德（国药准字H20110084，规格：25 mg/片）购自海南先声药业有限公司，4%多聚甲醛、10%乙二胺四乙酸二钠购自百灵威科技有限公司，p38 MAPK-IN-1（批号：HY-12839，规格：5 mg）购自美国MedChemExpress公司，二甲基亚砜（批号：D103277，规格：25 ml/瓶）、PBS（批号：P196987，规格：500 ml/瓶）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，牛Ⅱ型胶原蛋白购自武汉艾美捷科技有限公司，冰乙酸购自上海麦克林生化科技有限公司，弗氏完全佐剂购自上海碧云天生物技术有限公司，番红O-固绿染色剂购自北京索莱宝科技有限公司，ELISA试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司。

1.2动物分组与处理 雌性SD大鼠50只，购于浙江大学动物实验中心[生产合格证：SCXK（浙）2018-0006]。按随机数字表法分成5组：模型组、艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组、联合组（艾拉莫德+p38 MAPK-IN-1）、对照组，每组10只。将牛Ⅱ型胶原蛋白溶于冰乙酸，制成浓度为2 mg/ml的牛Ⅱ型胶原蛋白溶液；4℃过夜，与弗氏完全佐剂按1∶1的比例进行充分混合，制成Ⅱ型胶原蛋白乳剂，在模型组、艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组、联合组组大鼠尾根基部皮下多点注射0.1 ml，21 d后同法再次注射以加强免疫反应；28 d后大鼠四肢皮肤发红、皮温升高、软组织肿胀明显且伴有关节强直、不能负重，提示建模成功。对于对照组大鼠，采用同样方法注射PBS 0.1 ml。参考Hou等[9]研究，建模成功后第2天，艾拉莫德组按25 mg/kg剂量腹腔注射艾拉莫德（溶于0.2 ml二甲基亚砜后再用PBS定容至0.5 ml）；p38MAPK-IN-1组按10 mg/kg剂量注射p38 MAPKIN-1（溶于PBS并定容至0.5 ml），联合组给予10 mg/kg的p38 MAPK-IN-1和25 mg/kg的艾拉莫德腹腔注射（艾拉莫德溶于0.2 ml DMSO后加入p38 MAPK-IN-1，用PBS定容至0.5 ml），模型组、对照组给予腹腔注射PBS 0.5 ml。每隔4 d注射1次，共7次。治疗期间观察大鼠踝关节一般情况，测量大鼠体重及右后足厚度，评估类风湿关节炎评分；治疗28 d后断颈处死大鼠，手术取足部及整个胫骨下段行番红O-固绿染色，心脏穿刺取血检测炎症因子水平。

1.3 观测指标

1.3.1 踝关节一般情况 观察5组大鼠踝关节一般情况，包括皮肤色泽、皮温、感染、肿胀、行动能力等。

1.3.2大鼠体重及右后足厚度 在建模前1 d（记为治疗0 d）及治疗后1、14、28 d使用电子天平测量大鼠体重，游标卡尺测定大鼠右后足厚度。

1.3.3 类风湿关节炎评分 大鼠后足无关节炎表现为0分；后足1～2个关节发红、软组织肿胀为1分；3～4个关节发红、软组织肿胀为2分；≥5个关节发红、软组织肿胀为3分；出现严重关节炎为4分。

1.3.4 滑膜增生和关节软骨破坏情况 采用番红O-固绿染色法。取大鼠足部及整个胫骨下段，剥去皮肤、肌肉，暴露踝关节。4%多聚甲醛固定，10%乙二胺四乙酸二钠脱钙处理4周，脱水、浸蜡、切片，行番红O-固绿染色，晾干后中性树胶封片。在显微镜下观察踝关节切片滑膜增生和关节软骨破坏等情况。

1.3.5 炎症因子水平检测 大鼠心脏血37℃凝固1 h，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，使用全自动酶标仪（PT-3502，北京普天新桥技术有限公司）、ELISA试剂盒检测大鼠心脏血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 水平，严格按照试剂盒说明进行操作。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组大鼠踝关节一般情况 模型组大鼠踝关节皮肤发红，皮温升高，软组织明显肿胀，关节强直且不能负重；部分大鼠有明显的红斑和溃疡，行动能力受限明显。艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组皮肤发红、关节红肿等症状减轻，皮温降低，行动能力受限得到改善。联合组大鼠关节肿胀显著减轻，皮温明显降低，行动能力显著好转。对照组大鼠踝关节及后足各项表现均未见异常。

2.2 5组大鼠体重和右后足厚度比较 与对照组比较，模型组大鼠体重和右后足厚度均明显减少（均P＜0.05）；经艾拉莫德、p38 MAPK-IN-1治疗后，大鼠体重和右后足厚度均明显增加（均P＜0.05），其中联合组大鼠体重和右后足厚度明显大于艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组（均 P＜0.05），见表 1。

2.3 5组大鼠类风湿关节炎评分比较 模型组、艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组、联合组大鼠类风湿关节炎评分分别为（7.46 ± 0.85）、（5.84 ± 0.71）、（5.78 ± 0.74）、（4.17±0.64）分；对照组大鼠后足表现正常，类风湿关节炎评分为0分。5组大鼠类风湿关节炎评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组、联合组类风湿关节炎评分均明显降低（均P＜0.05），其中联合组明显低于艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组（均P＜0.05）。

2.4 5组大鼠踝关节滑膜增生和关节软骨破坏情况模型组大鼠踝关节表面软骨带基本消失；艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组关节面软骨稍有虫蚀样改变或变薄，但软骨带仅有少量软骨被侵蚀缺失，连续性的中断较少；联合组关节面软骨虫蚀样改变或变薄程度更低，软骨带基本维持完整，连续性的中断更少。对照组软骨组织与骨组织区分开，见图1（插页）。

图1 5组大鼠踝关节切片番红O-固绿染色所见（嗜碱性的软骨与番红O结合呈现红色，嗜酸性的骨与固绿结合呈现绿色或蓝色，×100）

2.5 5组大鼠血清炎症因子水平比较 5组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 水平比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与对照组比较，模型组大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β 水平明显升高（均 P＜0.05），而 IL-10水平明显降低（P＜0.05）；艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显低于模型组而高于联合组（均P＜0.05），IL-10水平明显高于模型组而低于联合组（均 P＜0.05），见表 2。

3 讨论

目前，类风湿关节炎的主要治疗方法有传统药物治疗、外科手术、生物制剂治疗等[10-11]，但未能满足有效控制病情的需要。随着对其发病机制的深入研究，发现一些具有抑制免疫球蛋白和细胞因子生成、抗炎、促骨形成、抗骨吸收作用的小分子调节剂在类风湿关节炎治疗中具有明显优势[12-13]。本研究对艾拉莫德联合MAPK通路抑制剂p38 MAPK-IN-1对类风湿关节炎大鼠的治疗作用进行了观察。

本研究首先利用牛Ⅱ型胶原蛋白构建类风湿关节炎大鼠模型，然后给予艾拉莫德、MAPK通路抑制剂p38 MAPK-IN-1治疗，结果发现艾拉莫德、p38 MAPKIN-1治疗后大鼠皮肤发红、关节红肿等症状减轻，足皮温降低，行动能力受限得到明显改善，体重和右后足厚度明显增加，而联合组的治疗效果更为明显。体重变化是评价药物对机体损伤的重要指标，临床上在治疗类风湿关节炎过程中多以体重变化评估患者的身体状况[14-15]。本研究结果显示联合组大鼠体重大于艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组，表明艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1治疗对机体损伤程度较低。此外，本研究还评估了类风湿关节炎评分，发现经艾拉莫德、p38 MAPK-IN-1治疗后，大鼠类风湿关节炎评分明显降低，其中联合组明显低于艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组，提示艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1治疗能明显改善类风湿关节炎临床症状。进一步行番红O-固绿染色观察骨质变化，发现联合组大鼠踝关节面软骨侵蚀程度明显降低，效果优于艾拉莫德组、p38 MAPK-IN-1组，与Dai等[16]研究结果相近。这进一步明确了艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1治疗有助于类风湿关节炎骨损伤的修复，为艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1用于类风湿关节炎的临床治疗提供了依据。

表1 5组大鼠体重和右后足厚度比较

表2 5组大鼠血清炎症因子水平比较（ng/L）

本研究进一步探讨了艾拉莫德联合p38 MAPKIN-1治疗类风湿关节炎的作用机制，以期为艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1用于临床提供理论基础。相关研究指出，IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子是类风湿关节炎致病的关键因子，能激活破骨细胞，从而促进骨的吸收，导致骨质流失的发生[17]。Uttra等[18]研究发现，降低IL-1β、IL-6、NF-κB 、TNF-α 等促炎因子的水平和增加IL-4、IL-10等抗炎介质水平，将有助于改善类风湿关节炎症状。本研究结果发现，经艾拉莫德、p38 MAPKIN-1治疗后大鼠 TNF-α、IL-6、IL-1β 水平低于模型组但明显高于联合组，同时IL-10水平高于模型组而明显低于联合组。这说明艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1治疗有助于抑制炎症反应，由此推测艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1对类风湿关节炎的治疗作用可能是通过抑制炎症反应实现的。有研究发现艾拉莫德在抑制花生四烯酸级联反应方面与选择性环氧酶-2作用相似，且能有效抑制成纤维细胞释放前列腺素[19-20]，从而抑制促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的释放，提高抗炎介质IL-10水平，从而有助于骨再生和抑制炎症反应，缓解临床症状。Kanashiro等[21]研究发现，活化p38 MAPK可通过抑制交感神经而促进关节中性粒细胞浸润。相关研究报道抑制MAPK信号通路可起到抑制类风湿关节炎患者炎症反应和关节破坏的作用[7]。p38 MAPK-IN-1是p38 MAPK的新型高效选择性抑制剂，具有持续、低清除和良好的生物利用度[22]。p38 MAPK-IN-1的应用能够有效地抑制p38 MAPK活性，进而抑制炎症反应，减少骨质破坏。上述理论进一步解释了艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1抑制炎症反应、修复受损软骨和缓解临床症状的原因。

综上所述，艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1对类风湿关节炎大鼠具有抗炎和保护作用，可能通过抑制炎症反应实现，这为艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1治疗类风湿关节炎的临床应用提供了依据。但本研究也存在一定的局限性：（1）未探讨艾拉莫德联合p38 MAPK-IN-1治疗的不良反应以及对免疫指标的影响；（2）本研究采用艾拉莫德腹腔注射，其吸收和作用效果可能与常规口服有所不同，均有待后续深入研究。