利用冷冻聚焦离子束制备冷冻含水切片技术问题探讨

贾 星

(中国科学院 生物物理研究所，北京 100101)

聚焦离子束(FIB)技术利用高强度离子束(通常是镓离子)对材料进行纳米加工，目前已广泛应用于材料科学领域，其原理是离子束与试样表面原子之间碰撞将样品表面原子溅射出来从而达到切割的效果.近些年发展起来的利用冷冻聚焦离子束减薄技术(Cryo-FIB)制备冷冻含水切片已适用于冷冻透射电镜电子断层三维成像(Cryo-ET)高分辨率数据采集.Cryo-FIB可将厚的细胞、组织样品减薄至适合透射电镜成像的薄片(通常200～300 nm)来进行观察.这种利用Cryo-FIB进行切割减薄的方法避免了传统切片机冷冻切片技术产生的压缩、褶皱等假象的困扰，而且技术难度相对较低，制样的重复性和成功率大大提高.利用快速和高压冷冻技术保存的细胞内大分子复合物的结构信息可以通过Cryo-FIB减薄技术很好地呈现出来，为进一步高分辨率鉴定及结构解析提供更高的可信度.同时，这些结构存在于完整的细胞中，从而使Cryo-ET获得了原位接近生理状态的结构信息，不仅能够揭示大分子复合物的结构和它们在细胞内的位置，而且能够捕捉其不同功能状态下的结构动态.

近日来，发表在Nature Protocols杂志上的一篇文章详细介绍了利用Cryo-FIB 减薄细胞制备冷冻含水切片的试验步骤[1].该试验流程主要包括以下几个步骤：首先在电镜载网上进行细胞培养，或者直接将培养的细胞滴到电镜载网上，之后进行快速冷冻，接着将载网卡环后进行冷冻光镜观察确定切割位置，接着进行Cryo-FIB减薄，然后放到冷冻透射电镜中进行冷冻电子断层扫描成像，最后进行三维重构或其他分析.

除了详细的试验步骤，该文章还介绍了试验中的一些小技巧，其中需要注意的5个要点：(1)在使用Vitrobot仪器进行快速冷冻时，吸水滤纸要放在载网细胞的反面，正面则使用一张含氟聚合物薄膜(Aclar sheet)，这样避免了挤压吸水过程中细胞可能被滤纸粘走的状况.当然Leica公司的快速冷冻仪(型号EM GP)所设计的单面吸水更适用于该试验.(2)在Autogrid卡环后为了便于辨认其在扫描电镜和透射电镜上的切片方向，在卡环前就用marker笔在卡环的背面一端标记红色为扫描电镜上样方向，在距此90 °的侧面做黑色标记为透射电镜上样方向.(3)双束扫描电镜的离子枪和电子枪之间的夹角是52 °，在进行切割减薄时，离子枪与载网平面之间需要具有一定夹角，一般为8～15 °，二者之间夹角越小则得到的细胞切片面积就会越大一些.由于不同仪器配备的样品座的预倾角度不一样，因此在用离子束切割前样品台的倾转角度需要根据实际情况确定.(4)进行冷冻聚焦离子束减薄前需要在腔室内对样品沉积一层Pt进行保护，Pt沉积的厚度需要从气体注入系统(GIS)的温度、样品台位置和沉积时间等三个方面进行调整.Pt沉积后还需要进行Cryo-FIB成像，通过离子束照射释放有机Pt中的挥发成分，使Pt附着在样品表面.(5)由于试验过程中样品要在电镜腔室内放置几个小时，最先切好的切片表面可能沉积了一些污染，所以在下样前还需要用Cryo-FIB小束流(10～30 pA)对所有切片进行短暂的表面清理.最后文章总结了目前Cryo-FIB技术中出现的质量问题，例如载网破损产生的裂缝或者孔洞、Cryo-FIB切割过程中产生的窗帘效应、切片中的结晶、切片表面的冰污染、由于切片升温产生的豹斑状冰污染和切片上不均匀的厚度等.

针对Cryo-FIB中遇到的诸多瓶颈问题，本文从样品自身方面(如何将细胞铺在载网网眼中央，如何在光电关联后进行快速原位冷冻)、切割过程(如何实现自动化切割并提高成功率)以及切片质量(如何减小切片厚度，如何减少污染，如何控制精修的成功率)三个方面进行文献调研(如图1所示)，总结了近期相关文献中的解决之道.

图1 Cryo-FIB各种瓶颈问题汇总

利用Cryo-FIB减薄细胞，首先要有一个细胞位置和冰层厚度都合适的样品.试验人员经常遇到的问题就是细胞没有粘附在网眼中央而是在载网网格的框架上，或者一个网眼里团聚了多个细胞导致冻出的样品冰层很厚.Leeya[2]等提出了对细胞外基质进行“微图案化来”控制细胞形态这一技术.此技术主要用于力学生物学研究，例如细胞间作用力、细胞与胞外基质间的应力能量状态和细胞内牵引应力分布等.Toro-Nahuelpan[3]等提出将这一技术应用于Cryo-FIB减薄细胞.文章论述了对电镜载网进行无掩模的光照图案化，试验流程如下：首先在电镜载网上铺一层多孔碳膜，其次在多孔碳膜上包裹一层防污涂层阻碍蛋白质粘附，接着加入光引发剂，用紫外光将微图案投射到网眼中央，防污涂层被降解蚀刻出微图案，然后加入粘附蛋白使其附着在蚀刻出的微图案上，最后铺上细胞，细胞即可粘附在蛋白上.对比细胞在未处理的载网和利用无掩模光照图案法处理过的载网上的分布，可见传统电镜网格中大多数细胞都粘附在网格的框架上.在未处理的载网上，细胞随机分布，只有少数细胞分布在网格靠近中间的位置，需要人为寻找定位.而经过处理的载网，即在金网网格的网眼中央加上一个直径20 μm的纤维连接蛋白组成的微图案，可见所有细胞都定位在网眼的正中央.这样就大大增加了Cryo-FIB切割前细胞的可选数量，并且细胞位置可控.

光电关联为FIB的精准切割打开了一扇窗口，但是有些生物学的动态过程快于将样品从光镜转移到快速冷冻仪上的时间，Fuest[4]等提出了“原位微流控冷冻固定-CryoFIB-CryoET”整套试验流程.该试验设计了一个搭载在光镜上的微流控样品台装置，进行活细胞成像后直接在光镜下以毫秒级别进行冷冻固定，可以捕捉到细胞内高度动态性的活动，例如胞内运输、膜转运、细胞分裂、免疫细胞激活等过程.之后将样品取下并在液氮中转移到Cryo-FIB中进行原位定点切割，利用Cryo-FIB lift-out技术进行样品减薄制备冷冻含水切片，之后转移到透射电镜下进行数据收集.该文章的初步结果预示了将毫秒级的原位微流控冷冻固定与分子空间分辨率的Cryo-ET相联系来研究四维空间的生物学过程的大好发展前景.

在利用Cryo-FIB进行减薄细胞的过程中，大部分步骤都需要人工调节.人工操作费时费力，且切割质量和成功率取决于人员的熟练程度，通常仅白天工作，只能产出5～10片.人工操作需要每5～15 min执行一系列重复操作，例如确认样品位置、确认切割位置、逐步更改FIB切割束流、时刻注意样品是否有漂移、确认最后精修的切片位置等,过程繁琐,需要投入大量时间，而又低通量.

目前，有文献报道利用Cryo-FIB将细胞减薄过程自动化.Buckley[5]等发表题为“高通量原位结构生物学的自动化冷冻切片制备”的文章，该试验是在配备了Leica冷台和VCT500 冷冻传输系统的Helios Ux G4 DualBeamTM仪器上进行.作者首先通过人工操作选择一系列切割目标的位置、做标记、设定切割参数，然后通过运行所写的“autolamella”程序的脚本达到自动切割所有目标的位置.文中提到使用该流程可每小时完成5个切片.作者分别测试了3种样品，成功率分别为：酵母97%，动物细胞84%，微晶56%.其中酵母和动物细胞切片失败的主要原因是窗帘效应或切片破损.而微晶样品成功率低下的主要原因是该特定样品的不均一性，导致在精修的时候切片很容易弯曲进而失败.

Zachs[6]等提出了一套全自动循序切割方案.该试验是在配备了Leica VCT500 冷冻传输系统的Zeiss Crossbeam 550 FIB-SEM仪器上使用SmartFIB软件进行操作.首先对FIB的各个束流进行alignment，并拍一张载网全貌，储存初始坐标，再进行backlash correction，从而保存目标的最终坐标位置.然后设置一系列的粗切和精修参数，为了提高定位的精准性，在目标物附近引入了漂移矫正，这个过程大概每个细胞花费9 min.接下来是自动切割过程，首先是定位目标，接着做backlash correction和drift correction，然后是一系列的粗切参数设置和粗切过程.最后是精修过程，首先要进行切片的再定位，并做backlash correction和drift correction，之后将切片精修到300 nm.作者提到该试验流程能达到98%的粗切成功率和95%的精修成功率.使用该流程可以在一个载网上切20个酵母细胞的切片.在精修的过程中，微小的漂移会导致得到的切片厚度在155～379 nm不等.在透射电镜下，作者在测试的酵母细胞切片中观察到了细胞核、核孔复合物、细胞核内的微管以及原纤维、细胞质中的核糖体、囊泡、线粒体等结构.作者还测试了蓝藻细胞，观察到了类囊体膜、藻胆蛋白体、间隙连接.在多细胞蓝藻菌中，细胞之间的隔膜包含一个肽聚糖盘和两层细胞质膜.间隙连接呈管状横贯营养细胞间隙，包含管、塞和帽等3个模块.三维重构后得到的间隙连接的精细结构分辨率和前人发表的利用人工操作Cryo-FIB切割得到的结构的分辨率相当.该文章提出的试验流程大大缩短了人工和机器的投入时间，例如切16个切片之前需要10 h的人工投入，而现在只需要2.4 h.之前一个切片需要38 min的仪器运行时间,现在也可缩短到25.5 min.

Sebastian[7]等报道了一种Cryo-FIB自动切割的高效化试验流程.该文章不仅提出了一个新的自动化软件切割方案，而且还针对切片质量中的厚度及冰污染问题提出了解决方案.切片上的冰污染主要有两个来源：实验室湿度环境和SEM-FIB腔室环境.为解决实验室湿度环境造成的冰污染，作者所在实验室设计了一个干燥的上样系统，包括一个手套箱、一个通用的样品准备台(包含autoloader卡环装置、Cryo-FIB传输上样台、autoloader cassette装置)和一个高真空的冷冻传输系统.其中手套箱内的湿度能够控制在1%以下，样品准备台可以在没有冰污染的情况下保持冷冻温度数小时.SEM-FIB腔室环境污染主要包括已切割样品碎屑的沉积以及腔室内水气沉积.其中已切割样品碎屑的沉积可以通过先统一粗切再统一精修来解决.腔室内水气沉积主要由腔室内环境中的水气沉积速率和升华速率之间的动态关系决定，作者设计了一个大面积的Cryo-shield和一个可以挡在样品上方的Cryo-shutter来减小样品附近的水气分压，从而减少水气在样品上的沉积.由于样品表面温度决定水气升华速率，因此作者在样品台上设置了一个可加热的设备使样品温度维持在-165 ℃.这3个硬件的改造使水气沉积的污染速率从72 nm/h降到了5 nm/h，因此将得到的切片在进行三维重构后可以明显看到样品表面的沉积厚度大大减少.另外，作者基于AutoTEM Cryo software applications这一软件在Aquilos cryo-FIB/SEM仪器上进行自动化切割，其中还加入了接下来要介绍的为了防止切片弯曲而引入的“微型膨胀接头”方法.该自动化切割流程的成功率能够达到88%.

Cryo-FIB切片在进行精修的过程中常常会产生弯曲，这通常是由于冷冻后的碳膜和载网的热膨胀系数不同而使碳膜皱缩导致.Wolff[8]等提出了一种微型膨胀接头方案.该想法源于建筑工程学，例如水泥地板的施工，其中的缝隙可以提供物理缓冲.在细胞两侧分别切两条1 μm宽的缝隙，可以使78%的切片厚度保持在200 nm.如果不进行这一操作，切片成功率只有23%.该方案的缺点在于在进行数据收集的时候会产生beam-induced motion.作者认为这一缺憾可以通过增加输出照片帧数，并删除起始几张照片来弥补.

综上，本文就最近发表的利用Cryo-FIB制备冷冻含水切片技术问题的一些文章进行了总结和讨论，针对样品准备、高通量自动化切割、切片质量保障等方面提出了相关解决方案，以提高利用Cryo-FIB技术制备冷冻含水切片的成功率和通量.除此之外，利用冷冻聚焦离子束减薄生物样品还有一些容易凸显的问题，比如切片上出现的竖条纹，称为“窗帘效应”.对于常温的材料样品，其形成与聚焦离子束切割固有的倾斜侧壁密切相关，当样品有表面形貌起伏或成分差异时，会产生切割速率的不同，就会形成窗帘效应.解决办法通常是在样品表面用FIB诱导辅助沉积Pt保护层，使样品表面变得平坦，也可以通过改变样品位置，从表面没有起伏的面开始切割，从而避开其影响.对于冷冻的生物样品，只能通过Pt沉积进行保护，而冷冻条件下Pt沉积是通过冷冻吸附实现，并且气体喷出的量较少(约几秒钟)，随着切片不断被减薄，前端Pt层也越来越短，当Pt被切掉后离子束再切割就会对切片前端产生损伤使切片变短，并伴随窗帘效应.如要得到平整且薄的切片，就要求试验者在精修的过程中有丰富的经验和切割手法来保证切片的前端一直有Pt保护层.所谓“魔高一尺，道高一丈”，办法总比困难多，Cryo-FIB技术发展也是日新月异，如何将好的技术方案应用于自己的试验当中，需要每个试验者思考.

致谢：

由衷感谢中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台生物成像中心孙飞研究员、季刚正高级工程师在本文撰写过程中给予的指导建议.