过表达PCDH10基因对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响

王 飞，杨继鑫，陈智年，张永喜

1)新乡市中心医院普外二科 河南新乡 453000:

2)空军军医大学第一附属医院甲乳血管外科 西安 710000 3)新乡医学院第三附属医院肿瘤内科 河南新乡 453000

结直肠癌是第三大常见的恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的第四大原因，其在世界范围内发病率和死亡率均较高[1]。近几十年来随着筛查和治疗手段的进步，结直肠癌患者的生存率有所提高，但晚期结直肠癌患者的生存率只有5%[2]。因此探究结直肠癌发生和发展的机制，从而寻找治疗的新方法是提高患者生存率的重要途径。原钙黏蛋白10(protocadherin 10，PCDH10)是近年来新发现的基因，位于4q28.3染色体上，其编码的蛋白与细胞间黏附、细胞分化以及细胞间信息传递等过程密切相关[3]。多项研究[4-6]表明，PCDH10的异常表达及其启动子异常甲基化在乳腺癌、宫颈癌、肝癌等人类多种恶性肿瘤的生长、浸润和转移等过程中发挥重要作用。有研究[7]发现，PCDH10在结直肠癌组织中表达下调。本研究观察了过表达PCDH10对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响，为探索结直肠癌治疗的新靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料结直肠癌细胞SW620、HT29、LoVo、HCT116和正常结肠上皮细胞NCM460均购于中国科学院上海生物研究所细胞库。RPMI 1640培养基购于美国Gibco公司，特级胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶和MTT试剂购于美国Sigma公司，TRIzol试剂和慢病毒购于美国Invitrogen公司，pcDNA-PCDH10过表达重组质粒及空载质粒购于上海吉玛制药技术有限公司(质粒慢病毒包装由上海吉凯基因化学技术有限公司完成)，反转录试剂盒和SYBR Primix Ex Taq荧光定量PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司，细胞裂解液、BCA蛋白浓度试剂盒购于碧云天生物技术研究所，鼠抗人PCDH10抗体、鼠抗人PCNA抗体、鼠抗人MMP-2抗体、鼠抗人GAPDH抗体和山羊抗鼠二抗均购于美国CST公司，Transwell小室购于美国Millipore公司。

1.2细胞培养结直肠癌SW620、HT29、LoVo、HCT116细胞用含体积分数10%灭活胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每隔2 d更换1次新鲜培养基。正常结肠上皮细胞NCM460常规培养。当细胞贴壁生长且生长密度达80%以上时，使用2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。

1.3结直肠癌细胞和正常结肠上皮细胞中PCDH10mRNA表达水平的检测分别提取结直肠癌细胞SW620、HT29、LoVo、HCT116和正常结肠上皮细胞NCM460中总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。PCDH10上游引物5’-ACTGCTATCAGGTATGCCTG-3’，下游引物5’-GTCTGTCAACTAGATAGCTG-3’； β-actin上游引物：5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，共40个循环。以β-actin为内参，使用2-ΔΔCt法计算PCDH10 mRNA的相对表达水平。实验重复3次。

1.4SW620细胞实验分组将生长状态良好且处于对数生长期的SW620细胞接种于96孔板，于37 ℃培养箱中继续培养12 h，用含pcDNA-PCDH10(PCDH10组)和空载质粒(阴性对照组)的慢病毒感染SW620细胞(滴度为108TU/mL)，48 h后筛选稳定表达PCDH10的细胞株。同时设未感染的SW620细胞为对照(空白对照组)。

1.5 3组SW620细胞中PCDH10mRNA和蛋白表达水平的检测分别收集处于对数生长期的3组SW620细胞，同1.3方法检测PCDH10 mRNA的表达。另取SW620细胞，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度，加入等体积的上样缓冲液，加热10 min致蛋白变性，配制100 g/L SDS-PAGE，按50 μg/孔蛋白样品加样，电泳分离蛋白后电转至硝酸纤维素膜上，在100 g/L脱脂奶粉溶液中室温封闭2 h。加入按1∶1 000稀释的PCDH10一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入按1∶3 000稀释的二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化学发光显影，曝光并拍照。以GAPDH为内参，使用Image J软件分析各条带灰度值。目的蛋白相对表达水平为目的条带与内参条带灰度值的比值。实验重复3次。

1.6 3组SW620细胞PCNA和MMP-2蛋白表达水平的检测取各组SW620细胞，同1.5中方法采用Western blot法检测细胞中PCNA和MMP-2蛋白的表达，其中PCNA一抗和MMP-2一抗均按1∶1 000稀释。实验重复3次。

1.7 3组SW620细胞增殖情况检测分别取3组SW620细胞接种于96孔板，接种密度约2×103个/孔，待细胞贴壁后24、48、72、96 h向每孔细胞中添加20 μL 5 g/L MTT溶液，37 ℃孵育4 h，除去上清液，再每孔加入100 μL二甲基亚砜，混匀，避光振荡反应10 min，最后使用酶标仪测定波长450 nm处的光密度(OD)值，实验重复3次。

1.8 3组SW620细胞克隆形成能力检测取对数生长期的各组SW620细胞，以5×102个/孔接种到6孔板，每组设置3个复孔，每隔2 d更换1次培养液。培养14 d左右肉眼可观察到细胞克隆，弃去旧培养液，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，1 g/L结晶紫染色30 min，清水缓慢洗涤2次，风干后在显微镜(×40)下选取5个视野，观察并计数大于50个细胞的克隆数，以细胞克隆形成数表示克隆形成能力。实验重复3次。

1.9 3组SW620细胞迁移能力检测收集各组SW620细胞，用不含血清的培养液饥饿处理24 h，收集细胞并制成2×105个/mL的细胞悬液。将孔径为8 μm的Transwell小室放置在24孔板中，取200 μL细胞悬液添加到Transwell小室的上室，下室中加入600 μL含体积分数10%胎牛血清的培养液，将小室置于37 ℃培养箱继续培育48 h。取出小室，用棉签拭去上室细胞，40 g/L多聚甲醛固定20 min，1 g/L结晶紫染色20 min，PBS洗涤小室2次，风干后在光学显微镜(×200)下观察并计数穿过小室的细胞数。实验重复3次。

1.10统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。采用单因素方差分析比较不同细胞间PCDH10 mRNA表达水平以及3组SW620细胞增殖和迁移能力，PCDH10 mRNA和蛋白，PCNA、MMP-2蛋白表达水平的差异，两两比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1结直肠癌细胞和正常结肠上皮细胞中PCDH10mRNA表达水平的比较结直肠癌细胞SW620、HT29、LoVo、HCT116中PCDH10 mRNA的表达水平分别为(0.11±0.01)、(0.43±0.04)、(0.36±0.04)及(0.29±0.03)，均低于正常结肠上皮细胞NCM460(1.00±0.10)(F=119.229,P<0.001)，且在SW620细胞中最低，因此后续选择SW620细胞进行PCDH10功能探究实验。

2.2 3组SW620细胞中PCDH10mRNA和蛋白表达水平的比较结果见图1和表1。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，PCDH10组SW620细胞中PCDH10 mRNA和蛋白表达水平高于阴性对照组和空白对照组(P<0.05)。

2.3 3组SW620细胞中PCNA和MMP-2蛋白表达水平的比较结果见图2和表2。与阴性对照组和空白对照组比较，PCDH10组SW620细胞中PCNA和MMP-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。

1～3：分别为空白对照组、阴性对照组和PCDH10组

表1 3组SW620细胞中PCDH10 mRNA和蛋白表达水平的比较

1～3：分别为空白对照组、阴性对照组和PCDH10组

表2 3组SW620细胞中PCNA和MMP-2蛋白表达水平的比较

2.4 3组SW620细胞增殖和迁移能力的比较结果见表3。与阴性对照组和空白对照组比较，PCDH10组SW620细胞OD值在48、72、96 h降低，细胞克隆形成数和迁移细胞数减少(P<0.05)。

表3 3组SW620细胞增殖和迁移能力的比较(n=3)

3 讨论

已有研究[8]证实，PCDH10调节的细胞黏附作用与多数肿瘤的形成密切相关。近年来，随着对PCDH10基因研究的深入，发现其在多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用，其在肿瘤组织和细胞中多表现为表达下调或失活，作为抑癌基因参与肿瘤细胞增殖、生长、侵袭和迁移等多种生物学行为[9-10]。Ye等[11]研究显示，PCDH10在肝细胞癌组织和细胞中的表达下调，而PCDH10的表达上调可抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。林莹等[12]研究发现，PCDH10的低表达与胃癌患者淋巴结转移、TNM分期及预后密切相关，提示其可能成为预测胃癌患者预后的辅助指标之一。另有研究[13]报道，在胰腺癌细胞中PCDH10的表达水平下降，而过表达PCDH10可抑制胰腺癌BXPC-3细胞体外增殖、迁移和侵袭能力，并促进细胞凋亡。

本研究结果显示，与正常结肠上皮细胞比较，PCDH10 mRNA在不同结直肠癌细胞中呈低表达，提示PCDH10在结直肠癌中亦发挥抑癌基因作用。为进一步探究PCDH10在结直肠癌细胞中的作用，本实验选择结直肠癌细胞中PCDH10表达水平最低的SW620细胞为研究对象，通过感染含PCDH10过表达重组载体的慢病毒，构建稳定过表达PCDH10的SW620细胞。结果显示，过表达PCDH10能够降低SW620细胞增殖及克隆形成能力，抑制SW620细胞迁移能力，提示PCDH10基因可能在结直肠癌细胞增殖和转移过程中发挥重要作用。该实验结果与上述研究[9-13]相似。PCNA只存在于肿瘤细胞和处于增殖的细胞中，与细胞中DNA的合成有关，具有启动细胞增殖的作用，目前已将其作为反映细胞尤其是肿瘤细胞增殖状态的指标之一[14]。MMP-2是基质金属蛋白酶家族成员之一，其主要功能是降解细胞外基质，目前研究[15]表明其与肿瘤的浸润和转移密切相关。本研究结果发现，过表达PCDH10的SW620细胞中PCNA和MMP-2蛋白的表达水平均降低，提示PCDH10可能通过下调PCNA和MMP-2蛋白的表达抑制SW620细胞增殖和迁移。这与彭曦[16]关于PCDH10通过下调MMP-2阻碍多发性骨髓瘤细胞迁移能力的研究结果一致。

总之，本研究结果显示，PCDH10在结直肠癌细胞中呈低表达，过表达PCDH10能够抑制结直肠癌SW620细胞增殖和迁移能力，其作用机制可能与下调PCNA和MMP-2蛋白表达有关。本研究结果为进一步探究PCDH10在结直肠癌中的作用机制提供了一定的实验基础，随着对PCDH10基因研究的深入，PCDH10有望成为结直肠癌新的治疗靶点。