七氟醚对结直肠癌SW480细胞增殖、凋亡的影响

郑孝振，任益锋，刘 静，韩箫笛，王 莹

河南大学第一附属医院麻醉科 河南开封 475000

结直肠癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率随着我国老龄化的加剧和人们饮食结构、生活习惯的改变呈逐渐升高的趋势，已成为威胁国人身体健康的重大疾病[1-2]。目前，手术治疗为主、术后放化疗和中药辅助治疗的综合治疗是结直肠癌治疗的重要手段，而麻醉药管理是结直肠癌围术期的重要措施。越来越多的研究[3-5]显示，麻醉药对肿瘤细胞的生长和转移具有一定的抑制作用。七氟醚是常用的吸入麻醉剂，被证实可影响乳腺癌、肺癌和鼻咽癌等多种肿瘤细胞增殖、侵袭和凋亡[6-7]。七氟醚在结直肠癌围手术期发挥着麻醉诱导和维持的重要作用[8]。本研究通过观察不同剂量的七氟醚作用于结直肠癌SW480细胞后对细胞增殖、克隆形成、凋亡能力和细胞周期分布的影响，探讨七氟醚对结直肠癌生物学行为的影响及可能机制，为七氟醚在结直肠癌手术麻醉管理中的应用提供帮助。

1 材料与方法

1.1主要试剂七氟醚购于上海恒瑞医药公司，RPMI 1640培养基和胰蛋白酶购于美国Gibco公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，MTT试剂购于美国Sigma公司，RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡试剂盒购于上海碧云天公司，Bax、Bcl-2、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗购于美国Santa Cruz公司，β-catenin、c-Myc和CyclinD1抗体购于美国Abcam公司。

1.2细胞培养、分组与处理将来自中科院上海细胞库的SW480细胞加入含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。将处于对数生长期的SW480细胞接种于细胞板上，常规培养过夜。将细胞分为对照组、低剂量处理组、中剂量处理组和高剂量处理组。对照组常规培养6 h；后3组细胞于无菌密闭的玻璃箱(进气口连麻醉气体挥发罐，出气口连气体分析仪)内，在通路体积分数5%CO2的基础上，分别按照6 L/min流速通入体积分数1.7%、3.4%和5.1%七氟醚处理6 h。

1.3细胞增殖实验分组处理后，收集4组细胞，调整细胞密度为2.5×104个/mL，按200 μL/孔接种至96孔板，培养箱中常规培养48、72和96 h。弃培养液，加入10 μL MTT溶液(5 g/L)孵育4 h。再加入 150 μL DMSO振荡至MTT晶体溶解。使用酶标仪在490 nm波长处检测光密度(OD)值。实验重复3次。

1.4细胞克隆实验各组细胞以每孔1 000个接种至6孔板，培养箱内常规培养，待出现肉眼可见克隆时，取出培养板。PBS洗涤后，加入40 g/L多聚甲醛溶液固定。结晶紫染色。显微镜(×100)下观察克隆形成情况，超过15个细胞记为一个有效克隆。克隆形成率=(有效克隆数/种植细胞数)×100%。实验重复3次。

1.5细胞周期和凋亡实验胰蛋白酶消化后收集各组细胞，PBS洗涤，分别参照细胞周期检测试剂盒(PI单染法)和细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC/PI双染法)说明书步骤，上流式细胞仪检测细胞的周期分布和凋亡率。实验重复3次。

1.6Bcl-2、β-cantenin、c-Myc和CyclinD1蛋白的Western blot检测胰蛋白酶消化收集各组细胞，加入RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测总蛋白的浓度。将蛋白样品与等体积的Loading Buffer混合均匀，沸水浴5 min。每孔60 μg蛋白样品上样至100 g/L聚丙烯酰胺凝胶孔中行电泳分离，待分离结束后，电转至PVDF膜。以50 g/L脱脂奶粉封膜2 h后，加入按1∶1 000稀释的Bcl-2、β-cantenin、c-Myc、CyclinD1和GAPDH抗体室温孵育2 h，PBST洗膜15 min，加入辣根过氧化物酶(按1∶2 000稀释)标记的二抗室温孵育1 h。化学发光剂显影曝光，凝胶成像系统扫描分析。以目的条带与GAPDH条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 22.0分析，各组细胞克隆形成率、周期分布、凋亡率及Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白表达的比较使用单因素方差分析和SNK-q检验；OD值的比较采用3×4析因设计的方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组细胞增殖能力比较结果见表1。

2.2 4组细胞周期分布和细胞凋亡率结果见表2。

OD值：F组间=451.722，F时间=400.856，F交互=155.133，P均<0.001；克隆形成率：F=47.542，P<0.001；*：与对照组相比,P<0.05; #：与低剂量处理组相比，P<0.05; △：与中剂量处理组相比，P<0.05

2.3 4组细胞中凋亡相关蛋白及Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达结果见图1和表3。

表2 4组细胞周期分布和凋亡率比较(n=3) %

1：对照组；2～4：低、中、高剂量处理组

表3 4组细胞中Bcl-2、Bax、β-catenin、c-Myc和CyclinD1蛋白表达的比较(n=3)

3 讨论

本研究以体积分数1.7%、3.4%和5.1%七氟醚处理SW480细胞后发现，结直肠癌SW480细胞增殖和克隆形成能力减弱。该结果与李登平等[8]所得出的七氟醚可抑制结直肠癌HCT116细胞增殖活力的结果相吻合，七氟醚在抑制结直肠癌SW480细胞增殖过程中发挥着积极作用。

细胞周期调控紊乱是肿瘤细胞异常增殖的重要前提。有研究[9]指出，七氟醚可将肺腺癌A549细胞周期阻滞于G2/M期，抑制癌细胞增殖。Liu等[10]研究发现，七氟醚可通过上调miR-203表达将细胞阻滞于G1期，抑制乳腺癌细胞增殖。本研究结果显示不同剂量的七氟醚处理后G0/G1期SW480细胞百分比明显升高，而S期细胞百分比明显降低，且呈浓度依赖性，提示七氟醚可能通过诱导细胞周期阻滞抑制SW480细胞增殖。

肿瘤的发生发展不仅与细胞过度增殖有关，还与细胞凋亡减少有关。Yang等[11]指出，七氟醚可通过激活缺氧诱导因子-1α诱导头颈部鳞状细胞癌细胞凋亡。王建伟等[12]的研究结果显示七氟醚可使乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡增加。本研究结果显示不同剂量的七氟醚处理后SW480细胞凋亡率和促进凋亡蛋白Bax的表达水平明显升高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达水平明显降低。单晓山等[7]证实，七氟醚可通过上调miR-34a的表达抑制结直肠癌细胞转移。miR-34a是一个与细胞周期和凋亡关系密切的miRNA[13]，被证实可诱导结直肠癌SW480细胞周期阻滞于G1期并诱导细胞凋亡[14]。该研究结果表明七氟醚可诱导结直肠癌细胞凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt信号转导通路，游离态的β-catenin过度积累可引起该通路的过度激活，通过调控下游相关周期蛋白CyclinD1、原癌基因c-Myc等的表达，在结直肠癌细胞增殖和凋亡等过程中发挥重要的调控作用[15]。张玉河等[16]研究指出，七氟醚可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞转移。本研究结果显示不同剂量的七氟醚处理后，SW480细胞中β-catenin、CyclinD1、c-Myc蛋白的表达呈浓度依赖性降低，提示七氟醚可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制结直肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。

综上所述，七氟醚可抑制SW480细胞增殖，并促进细胞凋亡，其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化有关。