分子伴侣对壳聚糖酶OUC-Csn21c在枯草芽孢杆菌中表达的影响

初文琴，刘振，刘昕，毛相朝,2*

(1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266000； 2.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室，山东 青岛 266000)

壳聚糖酶具有巨大的工业应用价值，主要用于酶解壳聚糖制备壳寡糖，壳寡糖与壳聚糖相比，具有较高的生理活性，如抗菌、抗氧化、抗肿瘤及降血压等[1-2]。壳寡糖制备方法主要有物理化学法和酶法，与物理化学法相比，酶法制备具有反应条件温和、特异性强、无副产物、绿色环保和易控制等优点[3]。因此，酶法(壳聚糖酶)制备壳寡糖已成为当前研究的热点。

壳聚糖酶主要通过野生菌株和构建基因工程菌株的方法制备。目前已从自然界中分离纯化出多株可产生壳聚糖酶的野生菌株，如Zitouni等[4]从Paenibacillussp. 1794中分离纯化了一种耐热壳聚糖酶Csn1794，纯化后的比酶活可达122 U/mg；方祥年等[5]从球孢白僵菌Beauveriabassiana1316-V1中分离纯化得到的壳聚糖酶的酶活可达45 U/mg。但是野生菌的壳聚糖酶产量较低，无法实现工业化生产，因此，很多研究者致力于对不同来源的壳聚糖酶进行异源高效表达，如分离于Bacillussp. TS的壳聚糖酶成功在大肠杆菌中表达，酶活可达186 U/mL[6]；分离于B.subtilisHD145的壳聚糖酶在Pichiapastoris中实现胞外表达，酶活可达9 000 U/mg[7]；分离于B.subtilis168的壳聚糖酶在B.subtilisPT5中成功表达，且在信号肽aprE介导下，使胞外酶活达到(156.00±4.68) U/mL[8]。

本研究表达的壳聚糖酶OUC-Csn21c已在大肠杆菌(Escherichiacoli)中成功表达(粗酶活可达100.4 U/mg)，该酶属于糖苷水解酶GH-46家族，是一种外切酶，其酶解产物为D-氨基葡萄糖和壳二糖，可用于工业生产氨基葡萄糖和壳寡糖[9]。本研究选择的宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，相较于大肠杆菌，枯草芽孢杆菌表达系统具有一些自身优势[10]：1)安全无毒，美国食品药品监督管理局(FDA)将其评为生物安全(generally regarded as safe，GRAS)菌株；2)具有较高的同源蛋白质和异源蛋白质分泌能力。

为进一步提高壳聚糖酶OUC-Csn21c在枯草芽孢杆菌中的胞外表达量，本研究探究了2种分子伴侣对其胞外表达量的影响。其中分子伴侣是介导其他多肽正确组装的一类蛋白质家族，但本身并不是蛋白质最终结构的组成部分[11]，其功能是确保蛋白质的正确组装。本研究选择PrsA和CsaA 2种分子伴侣是，因其来源于枯草芽孢杆菌，且有研究证明二者可提高胞外蛋白的分泌量。研究发现，PrsA作用于细胞膜与细胞壁之间的蛋白[12-13]。杨何宝等[14]通过整合分子伴侣PrsA使得蛋白酶的活性提高了23%；陈景奇[15]通过整合分子伴侣PrsA使淀粉酶AmyLM2和AmyS的酶活分别提高了3.2倍和5.5倍。CsaA通过提高分泌前蛋白的转位能力，使其更容易被突变SecA蛋白识别并作用，或者是通过刺激提高SecA蛋白的转位活性来实现外源蛋白的胞外分泌[16]。蒋红亮等[17]通过整合分子伴侣CsaA使青霉素酰化酶的酶活力提高66%。

本文选择枯草芽孢杆菌作为表达宿主，成功实现了壳聚糖酶OUC-Csn21c的胞外表达，并在此基础上探究了2种分子伴侣(PrsA和CsaA)对其胞外表达量的影响。

1 实验材料与方法

1.1 试剂材料

1.1.1 菌株及质粒

本文所用菌株及质粒如表1所示。

表1 本研究所用菌株及质粒Tab.1 Strains and plasmids used in this research.

1.1.2 实验试剂及仪器设备

本研究所用到的P505-d1聚合酶(PhantaTMMax Super-Fidelity DNA polymerase)和Taq聚合酶混合体系(2×Taq Master Mix)均购自南京诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme)。快速质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司(TIANGEN)。胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司。PCR引物由青岛生工生物科技有限公司合成。

本文所用培养基制备过程分别为：

1)LB培养基：10 g/L蛋白胨，10 g/L氯化钠，5 g/L酵母提取物，固体LB培养基中添加1.5%～2.0%的琼脂粉，121 ℃灭菌20 min后备用。

2)复苏培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，山梨醇91 g/L，甘露醇69 g/L，115 ℃灭菌30 min后备用。

3)电转培养基：山梨醇91 g/L，甘露醇91 g/L，葡萄糖100 g/L，115 ℃灭菌30 min后备用。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的扩增与纯化

壳聚糖酶OUC-Csn21c基因来源于链霉菌StreptomycesalbolongusATCC 27414，启动子Pshuttle09[18]由青岛生工生物合成，分子伴侣PrsA和CsaA基因均来自于B.subtilisWB800基因组。以上所有片段均通过PCR方法制备，片段Pshuttle09-prsA和Pshuttle09-csaA则是以融合PCR的方式分别通过引物43-09-F和prsA-R、csaA-R获得。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。使用胶回收试剂盒对扩增产物进行切胶回收。

1.2.2 目的片段与载体的连接

用无缝拼接试剂盒将ouc-csn21c整合到pP43NMK质粒上，形成质粒pP43NMK-Csn21c。然后，分别将Pshuttle09-prsA和Pshuttle09-csaA片段整合到pP43NMK-Csn21c上得到pP43NMK-Csn21c-PrsA和pP43NMK-Csn21c-CsaA。连接后的产物，通过化学法转化入E.coliDH5α并进行阳性克隆验证以及序列鉴定。

1.2.3 阳性克隆验证与质粒提取

用无菌牙签挑取平板上单菌落至含10 μL无菌水的1.5 mL离心管中混匀，然后吸取2 μL至PCR小管中，使用2×Taq Master Mix进行PCR验证，PCR验证体系为：2 μL模板DNA，6.25 μL 2×Taq Master Mix，3.25 μL无菌水，1μL DMSO。验证条带正确，则向剩余8 μL菌液的1.5 mL离心管内加入800 μL含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，37 ℃ 200 rpm培养4～6 h后送至青岛生工公司进行序列测定。序列测定正确的用质粒提取试剂盒提取质粒。

表2 实验所用引物序列Tab.2 Primer sequence used in this research.

1.2.4 枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800感受态的制备及转化

接种环蘸取冻存的B.subtilisWB800在无抗的LB固体培养基上划线，37 ℃培养过夜。挑取单菌落接种于10 mL无抗LB液体培养基，37 ℃ 200 rpm培养过夜，取3 mL培养物接种至40 mL 含0.5 mol/L山梨醇的LB培养基，37 ℃ 200 rpm培养至菌液浓度OD600达到0.85～0.95之间。然后，将菌液冰浴10 min，4 ℃ 5 000 rpm离心5 min，收集菌体沉淀。用预冷的电转培养基15～20 mL重悬菌体，4 ℃ 5 000 rpm离心5 min，如此重复3次。然后，用电转培养基1.0 mL重悬菌体，每管分装100 μL。

取1 μg左右重组质粒加入到100 μL感受态细胞中，1.8 kV电击1次，然后迅速用移液枪吸取1.0 mL复苏培养基吹打混匀，转移至1.5 mL的EP(eppendorf)管中，随后37 ℃ 200 rpm培养3 h，然后将菌液浓缩后涂布到含50 μg/mL卡纳霉素抗性的平板上，37 ℃培养过夜。

1.2.5 酶活测定

将10 μL发酵上清液加入到190 μL 2%的壳聚糖溶液中，55 ℃反应15 min后加入300 μL DNS溶液，沸水浴10 min终止反应，取200 μL于OD540下测定其吸光度值[8]，通过DNS的标准曲线确定其最终酶活。

酶活定义：每分钟水解壳聚糖产生1 μmol/L还原糖所需要的酶量为一个酶活单位(U)。

1.2.6 SDS-PAGE蛋白电泳

样品处理：取48 h发酵液8 000 rpm离心10 min，菌体用等量pH 8.0的Tris-HCl缓冲液重新悬浮。加入1.0 mL溶菌酶置于37 ℃反应30 min，破坏其细胞壁。随后超声破碎20 min，破碎液在8 000 rpm条件下离心15 min。分别取发酵上清、破碎液上清和破碎后沉淀各32 μL加入8 μL 5×loading buffer，煮沸10 min。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖酶OUC-Csn21c的异源表达

构建的质粒如图1a所示，将壳聚糖酶ouc-csn21c插入到质粒pP43NMK中。以链霉菌S.albolongusATCC 27414基因组为模板，成功扩增壳聚糖酶ouc-csn21c基因序列。图1b为壳聚糖酶ouc-csn21c扩增结果，序列长度为804 bp。通过DNAMAN软件预测该酶的分子量为29.6 kDa，蛋白电泳条带与预测大小相符(图1c)。

2.2 含分子伴侣PrsA和CsaA质粒的构建

将分子伴侣蛋白PrsA和CsaA分别插入到已构建成功的质粒pP43NMK-Csn21c上，同时用组成型启动子Pshuttle09对分子伴侣进行诱导表达，质粒图谱如图2a、2b所示。分别扩增片段Pshuttle09、prsA和csaA，然后用引物43-09-F和prsA-R进行融合PCR，得到片段Pshuttle09-prsA，大小为1 218 bp，用引物43-09-F和csaA-R扩增得到片段Pshuttle09-csaA，大小为672 bp(图2c)。阳性克隆鉴定结果显示，质粒的相应位置插入与理论大小一致的片段(图3)。测序结果显示序列并未发生突变，表明质粒构建成功。

2.3 重组菌株的表达

2.3.1 分子伴侣PrsA和CsaA对壳聚糖酶OUC-Csn21c胞外酶活的影响

重组菌株WB800/pP43NMK-Csn21c在24 h时生长已进入稳定期(图4a)，OD600可达1.4左右。酶活基本在24 h时达到较高水平，之后基本保持稳定。重组菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA(图4b)和WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA(图4c)在24 h时菌体浓度均已达到最高(OD600可达1.4)，重组菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA的胞外酶活同原始菌株相同，也在24 h时达到较高水平，之后基本保持稳定，但是重组菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA在24 h后胞外壳聚糖酶OUC-Csn21c的酶活仍在增长，直到48 h酶活达到最高，之后略有下降。

由于重组菌株均在48 h酶活达到最高，所以取各重组菌株发酵48 h的酶活结果进行比较，分子伴侣CsaA可使胞外壳聚糖酶OUC-Csn21c的酶活提高21.83%(图4d)，达4.76 U/mL。而分子伴侣PrsA却使其酶活下降，可能是由于分子伴侣PrsA的过量表达抑制了壳聚糖酶OUC-Csn21c的表达。

2.3.2 分子伴侣PrsA和CsaA对壳聚糖酶OUC-Csn21c外源表达量的影响

根据以上胞外壳聚糖酶OUC-Csn21c的胞外酶活结果，可以初步确定分子伴侣CsaA可以使其胞外表达量提高，为进一步确认，本研究对重组菌株的胞内外蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳分析(图5)，对比泳道5～8(胞外)发现，重组菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA的发酵液上清中，壳聚糖酶OUC-Csn21c的条带较深，泳道1～4为细胞破碎液的上清(胞内)；在29.6 kDa处，重组菌株WB800/pP43NMK-Csn21c和WB800/pP43NMK-Csn21c-PrsA均有条带，而重组菌株WB800/pP43NMK-Csn21c-CsaA的条带较浅。由此认为，分子伴侣CsaA可提高壳聚糖酶OUC-Csn21c的胞外分泌量。泳道9～12(包含体)可以看出，3个重组菌株的破碎液沉淀中均有与壳聚糖酶OUC-Csn21c大小一致的条带，且条带深浅基本一致，推断分子伴侣PrsA和CsaA对壳聚糖酶OUC-Csn21c胞内的正确折叠无明显促进作用。

3 结论

本研究以枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800为表达宿主，成功表达壳聚糖酶OUC-Csn21c，该酶分子量为29.6 kDa。经探究分子伴侣PrsA和CsaA对其胞外酶活的影响，发现分子伴侣CsaA可使其胞外酶活提高21.83%，为4.76 U/mL，而分子伴侣PrsA却使其胞外酶活降低。进一步利用SDS-PAGE蛋白电泳对提高胞外表达量的原因进行分析，发现分子伴侣CsaA通过提高壳聚糖酶OUC-Csn21c的胞外分泌量来提高其胞外表达量。本研究为壳聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达提供了一定的参考价值。