5种南极磷虾产品增强肠黏膜免疫的作用比较

袁诗涵，徐蓓蓓，曹婉秀，张旭，唐庆娟

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

南极磷虾(Euphausiasuperba)是南极海域主要的渔业捕捞品种，其数量巨大，繁殖速度快，被视为当今世界上生物储备量最大的生物之一[1]。目前，国内外对于南极磷虾的研究和利用主要集中在蛋白质和脂质等营养成分分析领域[2]。南极磷虾中蛋白质的含量约为12%～15%，生物效价优于牛乳蛋白，富含全部种类的人体必需氨基酸，符合FAO/WHO推荐标准，是人类潜在的蛋白储备库[3]。另有研究表明，南极磷虾蛋白安全无毒，且生物利用率高，是一种高品质动物蛋白资源[4]。因此，南极磷虾蛋白的深加工及其产业化发展具有广阔前景。由于中国南极磷虾渔业处于起步阶段，磷虾的综合利用研究相对滞后，如何促进南极磷虾加工业由生产初级食品向高附加值产品转变的问题亟需解决[5-6]。目前，虾粉、虾肉和虾糜是南极磷虾深加工的基本原料。南极磷虾经脱壳冻干得到虾肉；脱壳后沥水、冻干得到虾糜；加水经蒸汽处理后沥水、干燥及粉碎后得到虾粉[7-8]。脱脂虾粉是南极磷虾提取磷虾油后的副产品，价格低廉且含有丰富的蛋白质[9-10]，脱氟虾粉可以避免南极磷虾中氟含量过高对机体造成的损伤[11-12]。然而，高附加值的南极磷虾蛋白产品市场知名度较低，对经过不同加工处理的南极磷虾产品生物功效的研究相对较少，尤其是对肠道黏膜免疫的影响尚未明确。

食物被机体摄入后，首先作用于肠道黏膜，从而对机体免疫产生影响。肠道黏膜免疫是机体第一道免疫防线的重要组成部分，包括肠道特异性免疫和非特异性的肠黏膜屏障[13-14]。正常的组织结构是肠道发挥免疫功能的重要保证，小肠绒毛长度与隐窝深度的比值可以反映小肠的消化吸收与免疫机能状态[15]。闭合蛋白(occludin)、紧密连接蛋白(claudin-1)及闭合小带蛋白(ZO-1)在控制物质穿过肠上皮细胞时发挥主要作用，能够阻止大分子、毒素及细菌等物质通过，是肠黏膜机械屏障的重要组成部分[16]。促炎因子IL-6和抑炎因子IL-10参与炎症反应，调节炎性细胞因子的水平，影响细胞免疫应答，稳定肠道黏膜内环境[17]。当肠黏膜屏障受损时，淋巴细胞被激活，免疫应答随之启动，产生大量分泌型免疫球蛋白A(sIgA)。sIgA是黏膜表面分泌量最大的一类免疫球蛋白亚型，能够保护肠黏膜屏障功能，降低肠道病原体入侵导致全身性免疫反应的风险[18-19]。

本研究通过大鼠模型，研究磷虾肉、磷虾糜、普通磷虾粉、脱脂磷虾粉和脱脂脱氟磷虾粉5种不同加工处理所得的产品对肠黏膜免疫的影响，从而明确不同磷虾产品增强肠道免疫的作用，评定磷虾产品的生物活性及安全性，为南极磷虾蛋白的开发利用提供理论依据，促进南极磷虾的精深加工发展。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

主要包括：冷冻南极磷虾，购于中国水产股份有限公司。5种磷虾产品蛋白的制备及含量的检测参照本课题组前期建立的方法[10]。南极磷虾去壳冻干得到虾肉，蛋白质含量为(72.34±0.38)%；去壳采肉后经漂洗、挤压、沥水及冻干得到虾糜，蛋白质含量为(77.34±0.41)%；取虾糜加水经蒸汽处理、挤压、沥水、热风干燥并粉碎后得到普通虾粉，蛋白质含量为(65.12±0.52)%；普通虾粉经95%乙醇处理，过滤后取滤渣自然风干燥得到脱脂虾粉，蛋白质含量为(73.28±0.79)%；脱脂虾粉经0.3 mol/L HCl(1∶10，w/v)酸处理后取沉淀，重复3次后热风干燥得到脱氟虾粉，蛋白质含量为(78.17±0.68)%。

SPF级Sprague-Dawley大鼠雄性60只(4周龄，体质量80～100 g)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(动物许可证号：SCXK (京) 2016-0011)。

Trizol抽提试剂(美国Invitrogen公司)；5X All-In-One RT MasterMix、EvaGreen 2X qPCR Master Mix(加拿大ABM公司)；组织蛋白裂解液(RIPA+PMSF)、BCA 蛋白测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；抗体：大鼠单克隆GAPDH-HRP、羊抗大鼠IgA-HRP及羊抗大鼠IgG-HRP抗体(美国Proteintech公司)；分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、白细胞介素6(IL-6)及白细胞介素10(IL-10)ELISA Kit(苏州卡尔文生物科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

主要包括：Ultra Trurrax T18 Basic型手持高速匀浆机(德国IKA公司)；MR-23i 型高速冷冻离心机(法国Jouan公司)；BX41光学显微镜(日本Olympus公司)；Nanodrop 2000/2000C分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；Real-time PCR 仪(iQ5型)(美国Bio-Rad公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；GIS-2008 型凝胶扫描成像系统(上海天能有限公司)；Model680酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组

SPF级雄性SD大鼠在适应性饲养3 d后，根据体重将其随机分为6组：对照组、虾肉组、虾糜组、普通虾粉组、脱脂虾粉组和脱脂脱氟虾粉组，每组10只。饮食组成配比采用AIN-93标准，饲料配方参考Wong等[20]报道的方法，其中，对照组蛋白质来源为酪蛋白，其余5组分别为不同磷虾蛋白产品。根据各产品中蛋白质的含量配制饲料，使蛋白质含量为10%，其余各种成分比例不变[20]，饲料配方列于表1。所有大鼠采取自由进食饮水的方式，限制食物供给量为20 g/天。实验周期为4周，饲养条件：温度(22±2) ℃，湿度为(65±15)%。

1.3.2 肠道病理学组织切片与苏木素-伊红(HE)染色

大鼠处死后，取小肠空肠段2 cm，固定于4%的多聚甲醛中，24 h后经脱水透明、浸腊包埋，使用切片机切成5 μm厚度的切片。经过脱蜡、HE染色，用中性树胶封片[21]。在光学显微镜100倍放大倍数下观察组织病理变化，每个标本挑选6根最长且结构完整的绒毛，使用Image-Pro Plus 6.0图片处理软件测量绒毛长度(Villus length)和隐窝深度(Crypt length)，并计算V/C比值。

1.3.3 RNA的提取及RT-qPCR

在室温下使用TRIzol试剂，通过手持高速匀浆机提取来自小肠空肠段样品的总RNA，并使用Nanodrop 2000系统对其定量并检测纯度。用5X All-In-One RT MasterMix试剂盒将提取得到的RNA逆转录为cDNA。将cDNA稀释一定倍数后，使用EvaGreen 2X qPCR Master Mix试剂盒按照25 μL体系在X960实时PCR系统上运行，PCR扩增程序设定参考郑荣[21]报道的方法。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列列于表2。

表1 动物实验饲料成分表Tab.1 Ingredients of laboratory animal diets g

表2 引物合成序列表Tab.2 Primer sequences listing

1.3.4 Western Blot

取小肠空肠段4 cm于RIPA裂解缓冲液和PMSF(0.01 mmol/L)中匀浆，然后将裂解物离心收集上清液(12 000 g，5 min)。使用BCA试剂盒测定蛋白质浓度，并将其调为一致，然后与SDS上样缓冲液混合并于100 ℃金属浴变性15 min，最后在10%SDS-PAGE凝胶上分离，设置电压为100 V，电泳至溴酚蓝刚跑出即终止电泳。通过半干法将蛋白质转移至0.22 μm PVDF膜，采用恒定电流转膜，依据目的蛋白分子量确定转膜时间，再用5%BSA溶液封闭。将膜与针对GAPDH的一抗孵育，4 ℃下过夜，再与二抗羊抗大鼠IgG-HRP在室温下连续孵育2 h，ECL显色，通过凝胶成像系统扫描凝胶图像；对于IgA则将膜与羊抗鼠IgA-HRP在室温下孵育2 h后即可显色。

1.3.5 ELISA

取小肠回肠段4 cm于生理盐水中在冰浴条件下匀浆，然后将匀浆液以3 000 r/min离心10 min，收集上清液。使用sIgA、IL-6和IL-10 ELISA Kit 测定小肠组织中sIgA、白细胞介素6(IL-6)及白细胞介素10(IL-10)的浓度。

1.4 数据处理

实验结果用平均值±标准偏差(x±SD)表示，由GraphPad Prism 8构建图形。数据分析采用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析，与对照组相比，P<0.05为存在显著差异，P<0.01为存在极显著差异。

2 结果与分析

2.1 南极磷虾产品对肠黏膜屏障结构的影响

2.1.1 肠道病理学组织切片观察

小肠组织形态如图1所示，结果表明，以酪蛋白为饲料蛋白质来源的对照组(LP)小肠结构完整，绒毛排列紧密且呈细长状，各实验组结果显示其组织形态无显著损伤，绒毛排列整齐有序。统计后发现，5种南极磷虾产品均可以在一定程度上使绒毛长度增加，提高V/C比值。其中，虾肉组(KMP)与脱脂脱氟组(DKP)相比对照组(LP)均出现显著升高(P<0.05)，平均分别升高33.66%、29.19%。结果表明，南极磷虾产品有益于维持小肠正常的组织结构及生理功能，增强肠道机械屏障功能，其中，虾肉组效果最为显著，脱脂脱氟组次之。

2.1.2 南极磷虾产品对肠道紧密连接水平的影响

不同南极磷虾产品对肠道通透性的影响如图3，与对照组相比可发现，5种磷虾产品均没有破坏肠道通透性，且脱脂脱氟蛋白组(DKP)闭合蛋白(occludin)与闭合小带蛋白(ZO-1)两种蛋白mRNA表达量显著增加(P<0.05)，平均分别升高61.51%、38.98%，紧密连接蛋白(claudin-1)升高44.06%；虾肉组(KMP)claudin-1的mRNA表达量显著增加(P<0.05)，平均升高61.07%，ZO-1和occludin分别升高30.64%和42.57%。肠上皮细胞间的紧密连接可以维持肠道的正常结构，阻挡病原微生物入侵机体[22]。结果表明，脱脂脱氟组与虾肉组的南极磷虾蛋白的摄入能够增强肠上皮细胞间的紧密连接水平，提高肠黏膜机械屏障水平。

2.2 南极磷虾产品对肠道炎症因子水平的影响

如表3和图4所示，与对照组相比，脱脂脱氟组(DKP)与虾肉组(KMP)白介素6(IL-6)水平均显著下降(P<0.05)，分别平均降低15.88%、14.89%；而虾肉组(KMP)白介素10(IL-10)水平均显著升高(P<0.05)，平均增加58.5%，脱脂脱氟组(DKP)增加30.0%。统计二者比值发现，5种磷虾产品均可以显著上调IL-10/IL-6比值。当机体免疫能力受损时，促炎因子IL-6水平有所上升，而IL-10是细胞免疫反应的负调节因子，水平会相应下降，研究中常用二者比值指示机体细胞免疫反应的水平。因此，南极磷虾产品可以调节细胞免疫反应，维持肠道黏膜内环境稳态，避免肠道炎症的发生。其中，虾肉组效果最为显著，与对照组相比，IL-10/IL-6比值平均增加86.25%(P<0.01)，脱脂脱氟组次之，平均提高54.54%(P<0.05)。

表3 肠黏膜IL-10、IL-6含量Tab.3 IL-10 and IL-6 contents in intestinal mucosa n=10，ng·g-1

2.3 南极磷虾产品对肠黏膜sIgA分泌的影响

SIgA是肠道黏膜屏障的效应因子之一，当其水平出现异常下降时，无法阻止细菌、病毒等病原体黏附于肠道，使肠道黏膜屏障受损[23]。图5结果表明，与对照组相比，5种受试物处理后，肠道sIgA含量均有所提升，其中，脱脂脱氟组(DKP)与虾肉组(KMP)水平显著增加(P<0.01)，平均分别提高30.36%、21.97%。结果表明，脱脂脱氟组与虾肉组的南极磷虾产品可有效增加肠黏膜sIgA分泌，对增强肠黏膜免疫屏障有促进作用，且前者增强作用更显著。

2.4 南极磷虾产品对肠道IgA水平的影响

IgA具有多种抗体活性，能够抗菌、抗毒素和抗病毒，是小肠中极为重要的免疫蛋白[23]。如图6所示，与正常组相比，各组肠道IgA蛋白相对表达量出现差异，其中，虾肉组(KMP)蛋白表达量显著增加(P<0.05)，平均提高30.24%；脱脂脱氟组平均提高7.64%。结果表明，虾肉组可有效提高肠道IgA蛋白表达水平，显著增强小肠组织的免疫功能。

3 讨论

目前，针对不同南极磷虾产品的蛋白质营养价值评价及生理活性、食用安全性的研究逐渐增多[24-25]。有研究表明，在大鼠模型中，南极磷虾蛋白支持蛋白质的合成，且对血脂没有负面影响[26]。南极磷虾作为优质蛋白质的新来源，应该根据加工产品的用途，选择相应的制备方法，从而体现其生物活性，以推动南极磷虾蛋白的精深加工发展[7]。

加工方式能够影响食品原料中功能成分的活性[27]。探究不同南极磷虾蛋白产品形式的营养特性，对提升南极磷虾产品价值具有重要意义[3]。已有研究指出，南极磷虾产品蛋白及其衍生物具有抗菌、降血压及抗氧化等作用[24,28]。迄今为止，针对南极磷虾产品对肠道黏膜免疫的影响尚未见报道。本研究从南极磷虾产品影响肠道免疫能力的角度考虑，通过建立大鼠模型，探讨了不同加工方式处理后磷虾产品对肠黏膜免疫的影响。

研究表明，5种南极磷虾产品可以在一定程度上增强大鼠肠黏膜免疫能力，这与Gao等[29]和朱旺明等[30]报道的磷虾粉与磷虾蛋白可以提高机体抗氧化和免疫性能的结论相一致。此外，5种磷虾产品提高大鼠肠黏膜sIgA分泌量的能力有所不同。虾肉组和脱脂脱氟组增强肠黏膜免疫的作用较为显著，提示二者对于大鼠肠道获得性免疫具有显著的改善作用[18]。进一步研究显示，虾肉和脱脂脱氟虾粉提高了小肠组织IgA的蛋白表达量，推测其可通过上调浆细胞IgA表达量，从而促进肠黏膜sIgA的分泌[19]。虾肉作为3种粗加工产品中方式最简单的一种，极大程度地保存了磷虾原有的蛋白结构与功能[10]，因此其增强肠黏膜免疫的效果尤为显著。而氟含量超标是限制南极磷虾蛋白资源开发利用的瓶颈问题。据测算，磷虾蛋白脱氟处理后，每年可获取400～500万t的优质动物蛋白，从而大大缓解了全球的粮食压力[31]。本研究中脱脂脱氟磷虾粉促进sIgA分泌量的能力优于虾肉，而提高IgA表达量的水平低于虾肉。不同加工方式处理后的南极磷虾产品对sIgA和IgA的影响呈现出差异，提示影响sIgA分泌的因素不仅限于IgA的表达量[32]。5种产品对肠黏膜免疫的增强作用存在差异，虾肉和脱脂脱氟磷虾粉相较于虾糜、普通磷虾粉和脱脂磷虾粉产品的增强效果更为显著，这是否与产品中非蛋白组分的含量与种类有关仍需进一步研究。

4 结论

5种磷虾产品均可以提高V/C值，增强肠道机械屏障，调节炎性细胞因子水平，改善肠道免疫屏障功能，维持肠道的健康状态。此外，虾肉和脱脂脱氟虾粉可以上调小肠IgA的表达，提高肠黏膜sIgA的分泌量，对肠道获得性免疫具有改善作用。以上结果表明，南极磷虾粉在脱脂脱氟处理后，仍然具有较好的增强肠黏膜免疫生物活性能力。本研究成果为南极磷虾产品的活性研究提供了理论基础，将促进南极磷虾作为新型蛋白资源在食品工业的应用，推动南极磷虾资源的综合开发。