淄博地区血小板捐献者HLA-A，B和HPA1-17分型资料库的建立*

周博 田茂生 马晨 任晓朦 朱传福

血小板主要用于止血和预防出血，但由于血小板表面存在复杂的抗原系统，多次输注血小板的患者会引起同种免疫反应，进而造成血小板输注无效（platelet transfusion refractory，PTR）。引起血小板同种免疫的抗原主要包括HLA-I类抗原和HPA。且血小板表面的HLA抗原主要为 HLA-A，B 抗原，而无 HLA-Ⅱ类抗原[1]。实践证明，为PTR患者输注HLA和HPA配型相合的血小板可以显著提高血小板输注效果。为此，我们采用PCR-SBT和PCR-SSP技术对淄博地区单采血小板捐献者HLA-A，B 和HPA1-17系统等位基因进行检测分析，探知其分布特点，以期建立起已知基因型血小板捐献者资料库，为临床PTR患者搜寻HLA/HPA基因匹配的血小板，并为进一步扩充山东省级区域的血小板捐献者库提供资料，现报告如下。

材料与方法

1 研究对象 本研究随机选择在本站登记、户籍为淄博地区汉族单采血小板献血者200名，其中男性178名，女性22名，年龄18～45 岁，采集静脉血5 mL，采用EDTA抗凝，放置–40℃冰箱保存备用。

2 仪器与试剂

2.1 试剂：HLA基因分型：HLAssureTM SE SBT HLA-A/B Typing Kit（中国台湾TBG TexasBiogen Inc. LotMA16081G2）；HPA基因分型：HPAtypeTM Platelet SSP Typing Kit（中国台湾TBG TexasBiogen Inc. LotM316101）; 天根血液基因组DNA提取试剂盒（批号：P4701）。所有试剂均在有效期内。

2.2 仪器：EZBead System 32 核酸提取仪，PE 9700扩增仪，eppendorf 5810R离心机，BIORAD凝胶成像系统，ABI 3730XL测序仪。所有设备运行正常，均符合使用要求。

3 操作方法

3.1 DNA制备：使用DNA提取试剂盒，严格按说明书进行操作，进行全血基因组 DNA 提取， DNA浓度（30～50）ng /μL，纯度A260/280=1.7～2.0。

3.2 HLA-A，B基因分型：采用PCR-SBT方法对HLA-A、B位点进行基因分型，结果由Accutype（Version: 1.5.673 5.332 29）软件判读，确定HLA中低分辨分型结果。

3.3 HPA1-17基因分型：采用PCR-SSP法严格按说明书进行操作，PCR产物分析采用TBE 缓冲液制备的2.5% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色，150 V电泳15 min后，在全自动凝胶成像仪上拍照记录结果，对照反应格局图，判断 HPA1-17基因型。

4 统计学分析 HLA和HPA基因频率采用直接计数法计算，并用χ2检验进行HPA分布的 Hardy-Weinberg平衡验证；比较淄博地区和其它群体中基因分布的差异采用χ2检验， HPA对偶抗原不配合概率（mismatch possibility, MMP）=2ab（1-ab），a、b为对偶抗原等位基因频率[2]。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 淄博地区血小板捐献者 HLA-A、HLA-B 位点基因频率 共检出HLA-A，B位点等位基因44个，其中HLA-A 位点低分辨等位基因15个，基因频率较高的是A*02 、A*24、 A*11、A*30、A*33（表1）;HLA-B位点低分辨等位基因29个，基因频率居前五位的是B*13、B*15、B*40、B*44、B*51（表2）。

表1 淄博地区血小板捐献者 HLA-A位点低分辨等位基因频率

2 淄博地区血小板捐献者HLA-A，B部分高频等位基因与中国其他地区和民族的比较，见表3。

3 淄博地区血小板捐献者HPA1-17基因型和基因频率分布 HPA1-17中，HPA4a、7a-14a、16a、17a呈单特异性，未检测出相应的对偶基因抗原 HPA-b;在 HPA1-17 中，杂合度最高的是 HPA15，基因型HPA15a /15a、HPA15a /15b、HPA15b/15b 的频率分别是 0.275 0、0.530 0、0.195 0; 基因型 HPA3a/3a、HPA3a /3b、HPA3b/3b的频率分别是 0.345 0、0.500 0、0.155 0（表4）。

4 淄博地区血小板捐献者HPA基因频率与不同国家和地区的比较 ，见表5。

讨 论

血小板输注无效（PTR）在临床上相当棘手，困扰着临床医生和病患。HLA抗体是导致PTR最常见的免疫因素，占所有免疫因素的80%和所有病因的11.7%[10]。淄博地区血小板捐献者HLA-A，B 中基因频率较高的有A*02、A*24、 A*11、A*30、A*33和B*13、B*15、B*40、B*44、B*51，与同属于山东地区的尹作梅等[3]报道的基因频率相比差异无统计学意义（P＞0.05）；淄博地区血小板捐献者HLA-A位点基因频率较高的前五位与中国其他地区和民族的比较后发现，A*02、A*24、A*33的基因频率差异不具统计学意义（P＞0.05）；A*11、A*30与广东[4]相比，A*30与北方汉族[5]、宁夏回族[6]、中国满族[7]相比差异具有统计学意义（P<0.05）。HLA-B位点部分高频等位基因与中国其他地区和民族比较后可以看出，B*15、B*40、B*51的基因频率差异无统计学意义（P＜0.05）；B*13与宁夏回族[6]、B*44与广东[4]相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。由此可见，淄博地区血小板捐献者HLA基因分布具有区域性特点，说明建立区域性已知HLA基因型血小板捐献者资料库具有重要意义。HPA即血小板特异性抗原，由于不同人群、种族和地区间的各个抗原的频率有可能不同，导致血小板免疫抗体产生的特点有差异，引发的血小板免疫性疾病的机会也有差异[11]。淄博地区血小板捐献者 HPA1-17中，杂合度最高的是HPA15，基因型HPA15a /15a、HPA15a /15b、HPA15b/15b 频率分别是 0.275 0、0.530 0、0.195 0。淄博地区的HPA-1-17系统基因分布频率与冯云飞等[8]报道差异无统计学意义（P＞0.05）；HPA-2与HPA-15系统和上海汉族[9]、中国台湾[8]相比较，HPA-5与重庆汉族[9]相比差异具统计学意义（P＜0.05）；淄博汉族与英国人[8]（白种人）及美国黑人[8]的遗传背景明显不同。因此淄博汉族人群与此二群体的基因分布在多个HPA系统差异具统计学意义（P＜0.05）。通过对HPA不配合率的计算发现，淄博地区血小板捐献者中HPA不配合率较高的为HPA3、HPA15，分别为0.365 8、0.373 4。本研究对淄博地区血小板捐献者HLA-A、B和HPA1-17基因多态性进行检测，分析探知了淄博地区血小板捐献者 HLA-A，B和HPA1-17的分布特点，初步建立了血小板捐献者HLA和HPA已知基因型资料库，可以为产生HLA、HPA抗体的患者选择HLA、HPA匹配的血小板输注，以提高血小板输注的安全性和有效性。目前，省内多家市级中心血站已初步建立起各自的区域性血小板供者库，鉴于山东人群遗传背景相近，有效整合现有各个地市血小板供者资源，建设一个省级区域性血小板资料库更具有实际意义，本研究必会成为正在完善中的山东省区域性血小板捐献者资料库的有益补充。

表2 淄博地区血小板捐献者 HLA-B位点低分辨等位基因频率

表3 淄博地区血小板捐献者HLA-A，B部分高频等位基因与中国其他地区和民族的比较

表4 淄博地区血小板捐献者HPA基因型和基因频率分布

表5 淄博地区血小板捐献者HPA基因频率与不同国家和地区的比较

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