3例B亚型标本的血清学表型和基因型结果分析*

孙嘉峰 杨晓俊 张爱 蔡鹏威 陈发文

ABO血型系统是人类最重要的红细胞血型系统之一，也是最早被发现的血型系统。该血型系统最常见且比较复杂，其在临床输血、器官移植、新生儿溶血病诊断及法医学鉴定中具有非常重要的意义。ABO血型通常分为A、B、AB、O四种表型，此外在人群中还存在许多亚型或变异型，表现为红细胞上A或（和）B抗原强度减弱或血清中出现不规则的抗A或抗B抗体。依据血清学特征，A亚型分为A2、A3、Aend、Ax、Am、Ay、Ael等[1]，Salmon[2]依照A亚型的分类标准，将B亚型分为B3、Bx、Bm、Bel，同时将不符合这4类亚型标准的其他弱表型归为Bw。本研究对3例B亚型标本采用血清学和分子生物学相结合的方法进行鉴定和分析，现报道如下。

对象与方法

1 对象 样本1为本院住院患者，女，37岁，腰椎间盘突出；样本2为本院住院患者，女，32岁，多器官功能障碍综合征；样本3为福建省血液中心送检的无偿献血者。

2 试剂与仪器 单克隆抗-A、抗-B血型正定型试剂，抗-H抗体试剂，反定型标准ABO红细胞由上海血液生物医药有限责任公司提供；人源性抗-A、抗-B由本实验室自制；抗-AB抗体试剂由法国Diagast公司提供；DG Gel ABO-CDE 卡由西班牙戴安娜公司提供；Biospin全血基因组DNA提取试剂盒由杭州博日科技有限公司提供； Baso 2005-2型离心机由贝索公司提供；ABI-2720 PCR仪由美国ABI公司提供；Gel DocTM XR+凝胶成像系统由美国BIO-RAD提供。

3 方法

3.1 血型血清学检测：依据全国临床检验操作规程[3]进行红细胞ABO血型正反定型，吸收放散试验和唾液ABH物质检测。

3.2 全血DNA提取：按照Biospin全血基因组DNA提取试剂盒说明书提取标本基因组DNA。提取后检测DNA纯度A260/280 1.6～1.8，浓度15～100 ng/μL。

3.3 ABO基因直接测序：采用天津秀鹏生物技术有限公司提供的特异性引物对ABO基因第6和第7外显子、第3内含子进行双链扩增，扩增产物由该公司提供测序服务。使用Chromas软件（2.23版本）与NCBI-dbRBC网站公布的序列进行比对，确定ABO基因突变的位点和类型。

结 果

1 血型血清学检测结果 样本1和样本2正定型与抗-A和抗-AB出现特征性的混合凝集外观，反定型血清中未检出抗-B抗体，吸收放散试验均检出B抗原，其中样本1的唾液中检出B抗原，两者血清学均符合B3亚型的特征；样本3正定型O型，反定型A，B细胞凝集强度相差2+以上，吸收放散实验未检出B抗原，血清学疑似Bel亚型（表1）。

表1 3例样本的血型血清学检测结果

2 ABO直接测序结果 对3例标本ABO基因第6和第7外显子、第3内含子PCR产物进行直接测序分析，与A101基因序列比较，样本1存在intron3+5G>A、261delG、526C>G、646T>A、657C>T、681G>A、703G>A、771C>T、796C>A、803G>C、829G>A、930G>A的杂合突变和297A>G的纯合突变，在血型抗原基因突变数据库中检索分析，确认样本1基因型为B303/O02，其中intron3+5G>A突变是B303亚型的特征性突变（图1A）。样本2存在261delG、297A>G、526C>G、541T>C、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、930G>A杂合突变，其基因型为Bx03/O01，其中541T>C突变为Bx03亚型的特征性突变（图1B）。样本3存在261delG、297A>G、646T>A、681G>A、771C>T、829G>A、502C>T、526C>G、657C>T、703G>A、796C>A、803G>C、930G>A杂合突变，其基因型为Bel03/O02，其中502C>T突变为Bel03亚型的特征性突变（图1C）。

讨 论

正确鉴定患者ABO血型是保证临床输血安全的重要前提。因此，正确鉴定常规血清学检测中正反定型不符的血型标本尤为重要。ABO亚型是引起血型正反定型不符的常见原因之一，其血清学判定标准通常是依据红细胞和血清抗体凝集强度、H抗原表达强度、吸收放散能力等。B亚型在我国并不少见，其中B3表型与抗-B和抗-AB出现特征性的2+强度的混合凝集视野，血清中多无抗-B抗体，唾液中含有正常量的B物质[4]；而Bx表型与抗-B出现弱的凝集，与抗-AB有较强的凝集，血清中含弱的抗-B抗体，分泌型者唾液中不一定能检出B物质；Bel亚型与抗-B和抗-AB无凝集，血清中含有抗-B抗体，吸收放散试验可检出B抗原，唾液中只有H 物质[1]。

ABO基因位于第9号染色体（9q34），由7个外显子和6个内含子组成，其中外显子6和7是ABO基因常见的突变部位，此外ABO亚型的形成还与第1～5外显子、内含子、启动子、增强子的突变有关，涉及的分子机制包括点突变、插入、缺失和重组等[5，6]。目前常用于辅助ABO亚型诊断的分子生物学手段有ABO基因分型、ABO亚型基因分型、ABO基因直接测序、克隆测序等方法[5,7]。我们对3例样本的ABO基因第6和第7外显子、第3内含子的核苷酸序列进行测序，确定其ABO基因型。

结合血清学和分子生物学检测结果综合分析，本研究中样本1血清学表现为B3表型，基因型为B303亚型。B303亚型具有明显的地区差异，台湾地区报道最多[8]。B303亚型是由于第3内含子处5G＞A的突变破坏了剪接供体位点的保守序列，致使剪接发生异常，从而导致mRNA处理过程中直接跳过外显子3，形成不含外显子3的B3转录本，最终形成N端缺乏19个氨基酸的B糖基转移酶[9]， 同时伴随α-1，3-D-半乳糖基转移酶（GTB酶）活性或特异性改变，导致B抗原表达减弱和混合凝集视野[10]。样本2血清学表现为B3表型，基因型为Bx03亚型。Bx03亚型最先由蔡晓红[11]等报道，在该报道中先证者与抗-B出现1+～2+的凝集，与抗AB出现3+～4+的凝集，血清中存在抗-B抗体，血清学表现与本研究报道有所不同。分析可能由于不同实验室采用的单克隆抗-AB抗体的效价及针对的抗原表位不同有关，或者Bx03亚型亦可表现出B3表型的特征。目前已确定的Bx亚型基因有9种，其主要突变均在第6、7外显子的位置，分别命名为Bx01～Bx09[12]。Bx03亚型是由于第7外显子541 T＞C突变导致W181R的氨基酸替换。181位氨基酸位于GTB酶16个氨基酸的内部无序环（残基179～194）中，这是一种接近酶裂口的结构特征，被认为是酶代谢的决定因素。同时W181也是与底物UDP-gal的UDP部分相互作用的残基之一，相邻的180位氨基酸突变已被证实破坏H抗原向B抗原的转化，导致B表型较弱[11]。样本3血清学疑为Bel亚型，吸收放散试验未检出B抗原，且即使获得唾液标本进行检测也不能检出B物质，还需家系调查辅助确认ABO血型，体现出血清学确诊ABO亚型的不足之处。通过基因测序分析确认其基因型为Bel03亚型。Bel03亚型502 C＞T突变导致168位精氨酸被色氨酸替换，可能通过降低GTB结构的稳定性而影响GTB的酶活性，从而使B抗原表达减弱[13-15]。

综上所述，对于ABO亚型的鉴定可采用血清学和分子生物学相结合的方法进行综合判断。通过基因测序等分子生物学手段，明确ABO亚型的基因突变位点，有助于了解其形成机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突