萎凋时间对丹霞8号主要生化成分和挥发性成分的影响

乔小燕 陈 维 马成英 陈 栋

(1. 广东省农业科学院茶叶研究所，广东 广州 510640；2. 广东省茶树资源创新利用重点实验室，广东 广州 510640)

萎凋是红茶、绿茶和白茶加工中第一道重要的基础工序。萎凋过程中既有物理变化，如含水量、叶片状态和光泽度[1]，也有化学变化，如咖啡碱、游离氨基酸和糖含量[2]、多酚氧化酶活性[3]。萎凋工序中的物理和化学变化为成品茶外形、滋味、香气和色泽等的形成奠定基础。茶叶挥发性成分依据嗅感的不同分为两类，第一类为嗅感为青草气的脂类降解产物，第二类是类胡萝卜素和萜类化合物降解产生的嗅感愉快的挥发性成分。萎凋过程中嗅感为青草气的挥发性成分减少，而愉悦的挥发性成分增加[2]。叶绿素则通过影响脂肪酸、类胡萝卜素氧化以及萜类代谢相关的衍生途径，从而影响茶叶香气[4]。目前，针对萎凋工序的研究主要集中于萎凋过程中生化成分[5]、多酚氧化酶[6]、苯丙氨酸解氨酶[7]和β-葡萄糖苷酶[8]等酶活性变化的研究，萎凋定向调控技术也是研究的热点之一[9]。鲜叶萎凋过程中，生化成分和挥发性成分的变化与适度萎凋是否存在相关性未见报道。研究拟以丹霞8号为试验材料，比较鲜叶在萎凋过程中主要化学成分和挥发性成分，探明生化成分和挥发性成分的变化规律，通过统计学方法，明晰其与萎凋时间的相关性，为今后科学萎凋提供数据支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料：丹霞8号，采摘标准为一芽二叶，种植于广东省仁化县红山镇；

表没食子儿茶素没食子酸(EGCG)、儿茶素没食子酸(CG)、没食子儿茶素没食子酸(GCG)、表儿茶素没食子(ECG)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、儿茶素(C)、没食子儿茶素(GC)、可可碱、茶氨酸和咖啡碱标准品：上海源叶生物科技有限公司；

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，配紫外检测器和色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；

Millipore纯水仪：ZMQS5001型，美国密理博公司；

恒温水浴锅：HHS型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

微量电子天平：FB124型，奥豪斯仪器(常州)有限公司；

紫外—可见分光光度计：752N型，上海菁华科技仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 鲜叶萎凋采用竹筛摊放自然萎凋法，摊叶厚度2.5 cm左右，参考丹霞8号红茶加工的最适萎凋时间，设置不同的萎凋时间，分别于0，5，9，16，23，26，28，32，50 h取样，重复3次。样品采用微波杀青3 min固样，提香机80 ℃干燥至含水量≤6%。制作的蒸青样，密封保存于4 ℃冰箱中。采茶和加工期间为多云天气，气温23～26 ℃，相对湿度68%～70%。

1.2.2 主要生化成分测定

(1) 茶多酚：按GB/T 8313—2002执行。

(2) 游离氨基酸总量：按GB/T 8314—2013执行。

1.2.3 儿茶素组分和生物碱测定 采用HPLC法[10]。

1.2.4 茶氨酸测定 采用HPLC法[11]。

1.2.5 叶绿素和类胡萝卜素测定 根据文献[12]，修改如下：称取0.5 g茶粉，加入少许碳酸钙，加入10 mL浸提液在三角瓶中，放在黑暗条件下2 h。滤纸过滤，用80%丙酮对25 mL容量瓶定容。提取液倒入1 cm光径比色皿内，以80%丙酮为空白测吸光度。选择波长663，646，470 nm。按式(1)计算叶绿素α、叶绿素b和类胡萝卜素含量。

c1=12.21×OD663 nm-2.81×OD646 nm，

(1)

c2=20.13×OD646 nm-5.03×OD663 nm，

(2)

c3=(1 000×OD470 nm-3.27×c1-104×c2)/229，

(3)

m=c×V×m1×1 000，

(4)

式中：

OD——样品测试液吸光度；

c1——叶绿素a浓度，mg/L；

c2——叶绿素b浓度，mg/L；

c3——类胡萝卜素浓度，mg/L；

V——提取体积，L；

m1——样品质量，g；

m——含量，mg/g。

1.2.6 挥发性成分的测定 采用HS-SPME-GC-MS法[13]，挥发性成分根据质谱数据在标准图谱数据库NST 14(2014)检索匹配，并结合保留时间进行定性。根据离子流峰面积归一化法计算各组分在总挥发物中的相对含量。每个温度梯度3个重复测定。

1.2.7 数据分析 所有数据统计及计算均使用Microsoft Excel 2013分析；Graphpad prism 6 软件绘图。采用SPSS 25软件对原始数据进行单因素方差分析。SIMCA-P软件进行主成分分析，并计算各变量的载荷值。

2 结果与分析

2.1 萎凋过程中生化成分分析

如图1(a)所示，茶多酚含量在0～23 h显著增加，23～32 h显著降低，50 h与16 h茶多酚含量差异不显著(P<0.05)。游离氨基酸含量0～23 h显著增加，23～50 h 显著降低，50 h含量为4.43%(P<0.05)。与Jabeen等[14]对茶鲜叶的研究结果一致，0～24 h萎凋叶中游离氨基酸含量增加，Dev Choudhary等[15]认为蛋白质水解成氨基酸是导致萎凋叶游离氨基酸含量增加的主要原因。茶氨酸占游离氨基酸总量的30%～60%，0～16 h茶氨酸含量显著降低，16 h茶氨酸含量为1.51%，16～28 h含量差异不显著，在28～50 h显著降低(P<0.05)。

如图1(b)所示，咖啡碱含量在整个萎凋过程中显著增加，50 h达到最大为7.80%(P<0.05)；可可碱则在0～50 h含量显著降低，在50 h为0.29%(P<0.05)。Sari等[16]的研究结果也证实0～8 h茶氨酸含量显著降低，咖啡碱含量显著增加，Tomlins等[17]认为萎凋过程中咖啡碱含量的增加与核酸代谢有关。试验中可可碱含量变化与咖啡碱相反，可可碱的减少是否与咖啡碱含量增加有关，还有待于进一步研究。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 不同萎凋时间萎凋叶中生化成分分析Figure 1 The chemical component analysis for leaves with different withering time

2.2 萎凋过程中儿茶素组分分析

如表1所示，0～50 h总儿茶素和非酯型儿茶素含量总体显著下降，酯型儿茶素含量0～32 h差异不显著，50 h显著降低到67.84 mg/g(P<0.05)。Ye等[18]则认为，0～21 h非酯型儿茶素含量差异不显著，酯型儿茶素降低但差异不显著。0～50 h GC、EGC和EGCG含量降低，与王丽丽等[19]和丰金玉等[20]的研究结果基本一致，萎凋过程中儿茶素组分降低。儿茶素可在多酚氧化酶和过氧化物酶的氧化聚合下形成儿茶素聚合物。研究证实，萎凋过程中多酚氧化酶和过氧化物酶活性是鲜叶活性的2～4倍[21]，可催化儿茶素形成茶红素和茶黄素。推测试验中儿茶素可能在多酚氧化酶和过氧化物酶的催化下转化为茶红素和茶黄素聚合体，导致萎凋叶中总儿茶素和非酯型儿茶素降低。

表1 萎凋叶中儿茶素组分分析†

茶叶中酯型儿茶素可降解为非酯型儿茶素，表型和非表型儿茶素间也是可逆的[22]。5～32 h萎凋叶中GCG和CG含量高于EGCG和ECG可能与儿茶素表型间的转化有关，EGCG和ECG分别转化为GCG和CG。当萎凋时间为50 h，GC保留率最低，为64.02%，EGC的保留率最高为77.80%；EGCG的保留率为67.58%，CG的保留率最高为96.58%。酯型和非酯型儿茶素的保留率基本一致，比例接近1∶1。

2.3 萎凋过程中叶绿素和类胡萝卜素分析

叶绿素和类胡萝卜素是影响茶叶香气质和香气量的重要组分。如图2所示，萎凋叶叶绿素a含量高于鲜叶，但0～50 h叶绿素a没有显著变化(P<0.05)。叶绿素b和类胡萝卜素含量在0～5 h显著增加，叶绿素b和类胡萝卜素在5～28 h含量显著降低，类胡萝卜素含量28 h最低，为0.18%；28～50 h显著增加(P<0.05)。与前人[23-24]的研究结果一致，萎凋过程中叶绿素和类胡萝卜素含量减少。萧伟祥等[25]认为鲜叶在摊放过程中，叶绿素通过叶绿素酶脱去叶绿醇基形成脱叶绿醇基叶绿素，时间越长，脱叶绿醇基反应加强，导致叶绿素b含量降低。与叶绿素b相比，在萎凋过程中类胡萝卜素含量降低主要是通过非酶促降解[26]。

2.4 萎凋过程中挥发性成分分析

由表2可知，鲜叶和萎凋叶共检测到51个挥发性成分，根据其化学结构，可分为萜醇、萜烯、烃类和酯类等13类。水杨酸甲酯是主要的酯类挥发性成分，在50 h含量最高为10.08%。吲哚是杂环化合物中主要的挥发性成分，以5 h含量最高(4.83%)。

由图3可知，5 h萎凋叶中脂肪醇、杂环化合物和萜酮相对含量最高，16 h萎凋叶中烃类和萜烯相对含量最高，萜醇相对含量则最低。50 h萎凋叶中酯类、萜醛、芳香醇、芳香醛和萜醇相对含量最高，萜烯相对含量最低。50 h萜烯相对含量是16 h的1/3，50 h萜醇相对含量是16 h的3倍。脂肪酮、脂肪醇、萜酮、芳香醛和芳香醇相对含量在不同萎凋叶中比较稳定。

萜烯和萜醇是萎凋叶中主体挥发性成分，萜烯是5～32 h萎凋叶主体挥发性成分，萜醇是0 h和50 h萎凋叶主要挥发性成分。C10萜醇和C10萜烯分别是萜醇和萜烯中主要挥发性成分。萜烯醇类主要以键合态糖苷形式存在于茶鲜叶，β-葡萄糖苷酶可将键合态糖苷水解，释放出萜烯醇类挥发性成分。试验中τ-萜品烯0～23 h相对含量增加，23～50 h相对含量降低。4-萜品醇0～16 h相对含量降低，16 h最低为6.53%，在23～32 h保持在14%～14.40%，到50 h橙花醇取代4-萜品醇成为主要的挥发性成分。福鼎大白茶在0～12 h自然萎凋过程中，β-葡萄糖苷酶活性逐步增强，12 hβ-葡萄糖苷酶活性是鲜叶的2.5倍[26]。因此，τ-萜品烯是丹霞8号鲜叶萎凋过程中释放的主要C10萜烯。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 萎凋叶中叶绿素和类胡萝卜素分析Figure 2 The chlorophyll and carotenoids analysis in withering leaves

2.5 主成分分析

2.5.1 生化成分、叶绿素和类胡萝卜素的主成分分析

以茶多酚、茶氨酸、儿茶素组分、叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素等16个成分为变量，进行主成分分析。由图4和表3可知，PC1、PC2和PC3解释了所有变量的81.83% 原始变异信息，在PC1上，0～16 h和23～50 h区分开[图4(a)]。变量载荷值可知，GC、EGCG和EGC载荷值为正，对PC1有正向作用。在PC3上进一步区分为：0，5～16，23～28，32～50 h，叶绿素a、类胡萝卜素和CG对PC3有正向作用。

图3 挥发性成分分类和相对含量分析Figure 3 Category and relative content of the volatile of different withering leaves

表2 萎凋叶中挥发性成分相对含量分析

续表2

由上可知，16 h和23 h是鲜叶萎凋过程中内含物成分变化的分界点，GC、EGCG、EGC对0～16 h萎凋叶的生化特征有决定作用；叶绿素a和GCG对23～28 h萎凋叶的生化特征有积极作用；叶绿素a和类胡萝卜素对32～50 h萎凋叶生化特征有积极作用。因此，不同萎凋阶段，对萎凋叶生化特征起决定作用的成分不同。

2.5.2 挥发性成分的主成分分析 以表2中的51个挥发性成分为变量，进行主成分分析。由图5和表4可知，PC1、PC2和PC3解释了挥发性成分83.52%原始变异信息。在PC1上，0～32，16，50 h明显区分开，16 h和50 h的香气轮廓则迥异于其他萎凋时间。β-水芹烯、α-萜品烯和α-水芹烯对PC1有正向作用、α-萜品醇和橙花醇对PC1有负向作用。在PC3上，0～23 h进一步区分为两个不同的香气轮廓，0～9 h和16～23 h的香气轮廓不同，脱氢芳樟醇、1-(1,4-二甲基-3-环己烯-1-基)乙酮、顺-茉莉酮、2-乙基-1-己醇和1-乙基-2-甲酰吡咯对PC3有正向作用，是引起0～9 h香气轮廓发生变化的主要原因。

图4 生化成分、叶绿素和类胡萝卜素的PCA分析Figure 4 The principal component analysis based on chemical components,chlorophyll and carotenoids

表3 3个主成分中载荷值(绝对值)前3个的变量†

图5 挥发性成分PCA分析Figure 5 The principal component analysis of the whole volatile

表4 3个主成分中载荷值(绝对值)前5个挥发性成分

由上可知，16 h和23 h是萎凋过程中香气轮廓变化的分界点；β-水芹烯、α-萜品烯和α-水芹烯对16 h萎凋叶香气轮廓有积极作用；癸醛和苯甲醛是影响23 h萎凋叶香气轮廓的最重要成分；α-萜品醇、橙花醇和癸醛、苯甲醛对26～32 h萎凋叶香气轮廓有决定作用；α-萜品醇、橙花醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、4-萜品醇、4-异丙基-1-甲基-2-环己烯-1-醇对50 h萎凋叶香气轮廓有决定作用。

3 结论

萎凋过程中丹霞8号萎凋叶生化成分特征和香气轮廓呈规律性变化，且各个阶段差异明显。16 h和23 h是鲜叶萎凋过程中生化成分特征和香气轮廓发生改变的关键时间点。萎凋时间为16～23 h时，萎凋叶生化成分特征和香气轮廓保持一致，与实际生产中的适度萎凋程度所需时间基本一致。生化成分(GC、EGC、EGCG、GCG、叶绿素a)和挥发性成分(β-水芹烯、α-萜品烯、α-水芹烯、癸醛和苯甲醛)可作为综合判别萎凋程度的重要指标。