青钱柳愈伤组织的离体保存*

冯 莹 林庆良 潘东明

(1. 泉州师范学院资源与环境学院 泉州 362000； 2. 福建农林大学 福州 350002)

离体保存自1975年由Henshaw和Morel首次提出后，以其占用空间小、无菌培养、人工和经费少、易于交流等优点(Villalobosetal.， 1995； Rayetal.， 2010； Engelmann， 2011； Vasanthetal.， 2011)，现已被应用于多种植物种质资源的离体保存，如： 半夏(Pinelliaternata)(刘修树等， 2018)、地枫皮(Illiciumdifengpi)(张乐等， 2015)、木薯(Manihotesculenta)(黎萍等， 2015)、菊花(Chrysanthemummorifolium)(王小乐等， 2019a； 2019b)。通过在培养基内添加生长抑制剂(刘连军等， 2016)、调节渗透压(Panetal.， 2014； Renzendeetal.， 2018； Nasiruddinetal.， 2018)等方法限制培养物生长，从而延长继代时间，实现植物的离体保存。但是，由于遗传变异的存在，保存材料及其与原先种苗的遗传稳定性检测也是十分必要的。目前，可通过细胞学、分子标记等方法检测保存材料的遗传稳定性。简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)是第二代分子标记技术，具有多样性高、重复性好等优点，现也被广泛地用于分析植物离体保存材料的遗传稳定性。

青钱柳(Cyclocaryapaliurus)属于胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)，是我国独有的单种属乔木植物，主要分布在江西、浙江、湖南、福建、四川等地山区(方升佐等， 2007)。现存的青钱柳以天然林为主，自然条件下，青钱柳繁殖能力弱，林下幼苗少(方升佐等， 2003)，且随着其药用价值的发掘，青钱柳天然林受到严重破坏。故而，青钱柳种质资源的保存就显得十分必要。

愈伤组织是适宜的离体保存材料。近年来，研究者们主要针对愈伤组织诱导与分化、易褐化等问题开展青钱柳离体培养的研究，初步建立了良好的愈伤组织诱导、分化体系(Huetal.， 2010； 谢寅峰等， 2011； 阮氏钏等， 2014； 吴玲利等， 2019)，并有效解决了愈伤组织褐化问题(冯莹等， 2019)，但关于青钱柳愈伤组织离体保存的研究尚未见报道。

本文以青钱柳愈伤组织为离体保存材料，在优化植物激素的基础上，通过添加渗透调节剂和生长抑制剂，探索出青钱柳愈伤组织离体保存的方法，并结合流式细胞术和SSR分子标记技术检测愈伤组织的遗传稳定性，以期为青钱柳种质资源的长期离体保存提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为青钱柳愈伤组织，该类愈伤组织呈黄绿色或绿色、颗粒小、表面干爽，是由叶片(来自福建永春种源)诱导的。

1.2 愈伤组织离体保存试验

挑取新鲜且生长一致的愈伤组织，培养于保存培养基(除特殊说明外，保存培养基组成为： 改良MS基本培养基、0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA、30 g·L-1蔗糖、6.0 g·L-1琼脂粉，pH5.8)。每瓶接种0.5 g愈伤组织(共4团)，每10瓶为一个组合，重复3次。称取不同保存时间段内愈伤组织的鲜质量，统计增殖倍数和死亡率，并观察生长状态。

采用日光灯为培养光源，培养条件为光照强度283.02 μmol·m-2s-1，光照时间为每天12 h，培养温度为(20±1)℃。

1.2.1 6-BA+IBA组合对愈伤组织离体保存的影响 采用二因素完全随机试验法，试验了保存培养基中6-BA+IBA浓度组合(6-BA浓度为0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1； IBA浓度为0.2、0.4 mg·L-1)对愈伤组织离体保存的影响。

①优：腰痛、腿痛均消失，腰部运动无限制，可正常生活及工作。②良：腰痛、腿痛显著改善，腰部运动无限制，可进行轻微的工作。③可：腰痛、腿痛有所好转，但不能独立活动及工作。④差：腰痛、腿痛、运动功能等无改善，或加重。

1.2.2 蔗糖浓度和保存时间对愈伤组织离体保存的影响 采用单因素完全随机试验方法，针对保存培养基中添加不同蔗糖浓度(30、45、50、55、60 g·L-1)进行愈伤组织离体保存试验。针对保存培养基内添加不同蔗糖浓度(30、45、50、55 g·L-1)，进一步比较不同保存时间(60、90、120、150、180 天)对愈伤组织离体保存的影响。

1.2.3 渗透调节剂对愈伤组织离体保存的影响 采用单因素完全随机试验方法，针对保存培养基中添加不同种类和浓度的渗透剂(甘露醇： 0、10、20、30、40、50 g·L-1； 肌醇： 0、10、20、30、40、50 g·L-1)进行愈伤组织离体保存试验。

1.2.4 生长抑制剂对愈伤组织离体保存的影响 采用单因素完全随机试验方法，针对保存培养基内添加不同种类和浓度的生长抑制剂(多效唑(PP333)： 0、2、4、6、8、10 mg·L-1； 丁酰肼(B9)： 0、2、4、6、8、10 mg·L-1)进行愈伤组织的离体保存试验。

1.3 离体保存的愈伤组织恢复生长和遗传稳定性

将黄绿色、颗粒状且颗粒小而疏松的愈伤组织(Ⅱ类型愈伤组织，离体保存培养基中培养)在改良MS+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼脂粉(pH5.8)离体保存培养基内进行离体保存，继代保存周期为90天，每继代1次记为一代。随机挑取不同保存代数的愈伤组织(增殖培养的愈伤组织T0、保存第1、3、5、7、9、11、13、15代的愈伤组织T1、T3、T5、T7、T9、T11、T13、T15)，分别进行细胞倍性分析和遗传稳定性分析。

1.3.1 恢复生长 取保存第15代的部分Ⅱ类愈伤组织重新接入增殖培养基(改良MS+0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼脂粉，pH5.8)和分化培养基(待发表，成分包括改良MS+6-BA+IAA+蔗糖+琼脂粉，pH5.8)，进行恢复生长培养。

1.3.2 细胞倍性分析 以叶片(来源于福建永春种源)为对照(CK)，采用流式细胞术法检测不同保存代数的愈伤组织(T1、T3、T7、T11、T15)细胞的倍性。采用Partec CyStain UV Precise P试剂盒提取愈伤组织DNA后，于流式细胞仪检测细胞倍性。

1.3.3 SSR分子标记技术检测遗传稳定性 采用CTAB法，分别提取叶片(对照，来源于福建永春种源)和不同保存代数的愈伤组织(T0、T1、T3、T5、T7、T9、T11、T13、T15)DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的完整性。参照Fan等(2013)的方法，筛选出4对引物，引物序列分别为： F1-F： 5′-ATTCCCC ACCCCCATCTC-3′，F1-R： 5′-CTCCTCCAGCGCAC ATAA-3′； F2-F： 5′-AGATGGCTTTTCAGATTTG-3′，F2-R： 5′-CGGAAACTTGAATCAGAG-3′； F3-F： 5′-CTGGCACGCACAATACAC-3′，F3-R： 5′-CCAAAAA GGGTTGAGCTT-3′； F4-F： 5′-TCCTCCACTTCCAATG AT-3′，F4-R： 5′-AGAGGAGCAAACAAACAT-3′。

采用SSR分子标记技术分析不同保存代数愈伤组织的遗传稳定性。以DNA为模板进行SSR-PCR扩增。PCR扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，经银染后拍照观察。

1.4 数据统计与分析

增殖倍数=转接的愈伤组织总瓶数/原培养的愈伤组织总瓶数； 愈伤组织的死亡率(%)=死亡的愈伤组织总团数/原愈伤组织总团数×100%； 愈伤组织净增长量(g)=60天愈伤组织鲜质量-0.5。

2 结果与分析

2.1 不同处理对愈伤组织离体保存的影响

2.1.1 离体保存的愈伤组织生长情况 观察愈伤组织在离体保存培养基的生长情况表明： 在保存60天内，随着培养时间的延长，愈伤组织在各类离体保存培养基内均可以繁殖(表1)，表现为不同的质地： Ⅰ类愈伤组织呈粉红色或红色，粉末状或颗粒状，质地疏松(图1A、B)； Ⅱ类愈伤组织呈黄绿色，颗粒状，颗粒小而疏松(图1C、D)； Ⅲ类愈伤组织呈米白色，团块状或粉末状，质地疏松(图1E、F)。

表1 愈伤组织在离体保存培养基内的质地表现Tab.1 The growth of callus cultured in the different conservation medium

图1 愈伤组织保存类型Fig.1 The type of callus in vitro conservation in C. paliurusA, B: I类型愈伤组织; C, D: II类型愈伤组织; E, F: III类型愈伤组织。 A, B: Type Ⅰcallus; C, D: Type Ⅱcallus; E, F: Type Ⅲcallus.

2.1.2 6-BA+IBA浓度组合对愈伤组织离体保存的影响 青钱柳愈伤组织离体保存60天时，添加0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA组合效果较好，愈伤组织死亡率为0，且生长较为缓慢，增殖倍数为3.52倍，与同为零死亡的0.6 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA组合达到显著性差异(表2)。当保存90天时，愈伤组织的死亡率均达到50%以上。

表2 6-BA+IBA对青钱柳愈伤组织离体保存的影响①Tab.2 The effect of 6-BA and IBA on in vitro callus conservation in C. paliurus

2.1.3 不同蔗糖浓度及其保存时间对愈伤组织离体保存的影响 试验结果(图2)表明： 保存60天时，与添加30 g·L-1蔗糖(对照组)相比，添加45～55 g·L-1蔗糖可有效地抑制愈伤组织生长，其鲜质量净增长量和增殖倍数逐渐降低，与对照组达到显著性差异，死亡率为0； 当蔗糖浓度为60 g·L-1时，愈伤组织鲜质量净增长量和增殖倍数为最低，但死亡率达到22.22%。

图2 不同蔗糖浓度对青钱柳愈伤组织离体保存的影响Fig.2 The effect of different sugar content on in vitro callus conservation in C. paliurus

进一步针对不同保存时间对愈伤组织离体保存影响的试验结果(表3)表明： 与添加30 g·L-1蔗糖(对照组)相比，添加45～55 g·L-1蔗糖保存60 天时，愈伤组织存活率均达到100%； 随保存时间的延长和蔗糖浓度升高，愈伤组织存活率逐渐降低。添加45 g·L-1蔗糖保存90 天时，愈伤组织存活率100%，与其他处理差异显著，愈伤组织质地为Ⅱ类型。

表3 不同保存时间对青钱柳愈伤组织离体保存的影响
Tab.3 The effect of different days oninvitrocallus conservation inC.paliurus

蔗糖浓度Sugar content/(g·L-1)存活率Survival rate(%)60 d90 d120 d150 d180 d30 100±0 a79.33±3.06 c24.00±4.00 d0±0 d0±0 b45 100±0 a100±0 a74.67±3.06 a38.00±4.00 a14.00±6.00 a50100±0 a88.67±3.06 b57.33±6.11 b26.67±3.06 b0±0 b55100±0 a68.00±3.00 d40.00±2.00 c14.00±4.00 c0±0 b

2.1.4 甘露醇对愈伤组织离体保存的影响 青钱柳愈伤组织离体保存60天时，与添加0 g·L-1甘露醇(对照组)相比，添加10～50 g·L-1甘露醇保存的愈伤组织生长缓慢，其鲜质量净增长量和增殖倍数呈显著性降低(图3A)，死亡率逐渐升高(图3B)。当保存90天时，10 g·L-1甘露醇保存的愈伤组织存活率为66.67%，其余浓度保存的愈伤组织死亡率均达到90.00%以上。

2.1.5 肌醇对愈伤组织离体保存的影响 青钱柳愈伤组织离体保存60天时，与添加0 g·L-1肌醇(对照组)相比，添加10～50 g·L-1肌醇保存的愈伤组织鲜质量净增长量和增殖倍数均先升高后降低(图4 A)，但死亡率逐渐升高(图4B)； 当保存90天时，愈伤组织死亡率均达到100%。

图3 不同甘露醇浓度对青钱柳愈伤组织离体保存的影响Fig.3 The effect of mannitol content on in vitro callus conservation in C. paliurus

图4 不同肌醇浓度对青钱柳愈伤组织离体保存的影响Fig.4 The effect of inositol content on in vitro callus conservation in C. paliurus

2.1.6 多效唑对愈伤组织离体保存的影响 青钱柳愈伤组织离体保存60天时，与添加0 mg·L-1多效唑(对照组)相比，添加2～10 mg·L-1多效唑保存的愈伤组织鲜质量净增长量和增殖倍数显著降低(图5A)，但死亡率逐渐升高(图5B)； 保存90天时，愈伤组织死亡率均达100%。

2.1.7 丁酰肼对愈伤组织离体保存的影响 青钱柳愈伤组织离体保存60天时，与添加0 mg·L-1丁酰肼(对照组)相比，添加2～10 mg·L-1丁酰肼可有效地抑制愈伤组织生长，愈伤组织鲜质量净增长量和增殖倍数先升高后降低(图6A)，但死亡率逐渐升高(图6B)； 当保存90天时，愈伤组织死亡率均达到100%。

图5 不同多效唑浓度对青钱柳愈伤组织离体保存的影响Fig.5 The effect of PP333 on in vitro callus conservation in C. paliurus

图6 不同丁酰肼浓度对青钱柳愈伤组织离体保存的影响Fig.6 The effect of B9 content on in vitro callus conservation in C. paliurus

综合蔗糖处理、渗透调节剂处理和生长抑制剂处理的结果表明： 适宜于愈伤组织的离体保存培养基为改良MS+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼脂粉，pH5.8，适宜的继代保存周期为90天，愈伤组织质地为II类型。

2.2 离体保存的愈伤组织遗传稳定性分析

2.2.1 恢复生长培养 恢复生长培养40天观察发现： 愈伤组织均能恢复生长，与T0在形态、生活力和生长势上没有差异(图7A、B)，并能够分化(图7C、D)。

2.2.2 不同保存代数愈伤组织细胞倍性的分析 对不同保存代数的愈伤组织细胞倍性检测结果表明： 与对照(叶片)相比，不同保存代数的愈伤组织细胞倍性没有发生改变(图8)，没有发生遗传性变异。

图7 青钱柳愈伤组织恢复生长Fig.7 Recovery growth of callus in vitro conservationA: T0代愈伤组织(对照); B: 保存15代后恢复生长的愈伤组织; C, D: 恢复生长的愈伤组织分化。A: Callus growth of T0 (control); B: Recovery growth of callus in vitro conservation (T15); C, D: Differentiation of callus after recovery growth.

图8 不同保存代数愈伤组织的细胞倍性检测Fig.8 Analysis of cell ploidy of different conservation time of callus in vitro conservationA: 叶片的细胞倍性(对照); B-F: 分别为保存第1、3、7、11、15代愈伤组织的细胞倍性; FL4: 荧光强度。A: Cell ploidy of leaf (CK); B-F: Cell ploidy of callus in vitro conservation(T1, T3, T7, T11, T15); FL4: Fluorescence intensity.

2.2.3 SSR分子标记技术检测不同保存代数愈伤组织的遗传稳定性 与叶片(对照)相比，不同保存代数的愈伤组织扩增图谱没有产生特异性条带(图9)。这说明保存材料稳定性好，没有发生遗传变异。

3 讨论

利用培养基的高渗透压抑制离体保存材料的生长，是植物离体保存的方法之一。通过添加蔗糖和甘露醇等渗透调节剂来提高培养基的渗透压，可抑制培养材料对水分和营养物质的吸收(Holobiuc, 2015； Thakuretal., 2015； Gomesetal., 2017； Vettorazzietal., 2017)，从而起到抑制离体材料的生长，实现离体保存的目的。本试验发现，保存培养基中添加适量的蔗糖(45～55 g·L-1)能有效地抑制愈伤组织的生长，但蔗糖(30 g·L-1)和甘露醇(≥10 g·L-1)组合、高浓度蔗糖(≥60 g·L-1)随着保存时间的延长均会导致青钱柳愈伤组织的死亡率增加。这同黎萍等(2015)、刘修树等(2018)、Muňoz等(2019)、王小乐等(2019a)、Pan等(2014)的研究结果一致。Nasiruddin等(2018)指出甘露醇和蔗糖组合有利于马铃薯(Solanumtuberosum)的离体保存，与本研究的结果不一致，这可能是由于不同植物离体保存的途径不同(Duetal.， 2012)。

培养基中添加植物生长抑制剂(如： 多效唑、丁酰肼)以减缓培养物的生长可实现植物离体保存(黎萍等， 2015； 刘连军等， 2016)。本试验发现，多效唑和丁酰肼虽然能明显地抑制愈伤组织的生长，但保存时间较短(≤60天)，且随着培养时间的延长，愈伤组织的死亡率增加，不适宜作为愈伤组织离体保存生长抑制剂。这同黎萍等(2015)、史芳芳(2015)的研究结果一致。但刘连军等(2016)指出PP3331.0～1.5 mg·L-1、B90.5～1.0 mg·L-1可以有效地延长木薯(Manihotesculenta)试管苗保存时间，提高存活率，是对木薯种质资源离体保存方法之一。这可能是由于植物生长抑制剂对不同离体保存材料的延缓作用表现不同。

图9 不同保存代数青钱柳愈伤组织的SSR分子标记Fig.9 Identification of in vitro callus conservation for different cultural time with SSR marker in C. paliurus1-11、12-22、23-33、34-44分别为F1、F2、F3、F4引物标记的SSR扩增产物； 每组样品依次为叶片(来源于福建永春种源)、不同代数的愈伤组织(T0、T1、T3、T5、T7、T9)、叶片(来源于江西井冈山种源)、不同代数的愈伤组织(T11、T13、T15)。1-11, 12-22, 23-33 and 34-44 mean SSR products with leaf from FujianYongchun, callus in vitro conservation from T0, T1, T3, T5, T7 and T9, leaf from Jiangxi Jinggangshan, callus in vitro conservation from T11, T13 and T15 by F1, F2, F3, F4, respectively.

离体保存是植物优良种质资源保存的一种较好手段，但离体保存时必须时刻关注其离体保存材料的遗传稳定性。本试验采用SSR分子标记技术和流式细胞术对不同保存代数的青钱柳愈伤组织遗传稳定性的检测结果表明，不同保存代数愈伤组织均未发生变异，遗传稳定性好。李晓艳等(2009)、白建明等(2010)、尹明华等(2015)、王小乐等(2019b)对越橘(Vacciniumspp.)、马铃薯、红芽芋(Colocasiaesculentavar.cormosuscv. Hongyayu)、菊花离体保存有类似的结果。

4 结论

在青钱柳保存培养基中添加生长抑制剂多效唑和丁酰肼及渗透调节剂甘露醇和肌醇均能抑制青钱柳愈伤组织生长，但不利于青钱柳愈伤组织的离体保存； 适宜的青钱柳愈伤组织离体保存的培养基为改良MS基本培养基+0.8 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1IBA+45 g·L-1蔗糖+6.0 g·L-1琼脂粉，pH5.8，该培养基可有效地限制青钱柳愈伤组织生长； 在(20±1)℃下每隔90天转接1次，是青钱柳愈伤组织离体保存继代的最佳途径。该途径下离体保存的愈伤组织能恢复生长和分化，遗传稳定性好，未发生变异。