碱处理与粒径大小对复合菌系MC1分解水稻秸秆性能的影响

马旭光，刘碧秀，何文静，周若昕，韩耀霞，江 滔，唐 琼

(1. 乐山师范学院 化学与资源环境学院，四川 乐山 614000；2.福建农林大学 资源与环境学院，福建 福州 315002)

0 引言

中国作为世界上农作物秸秆资源最丰富的国家之一，每年可产生各类秸秆8亿多吨，其中水稻秸秆的蕴藏量占总量的27%。四川省是秸秆分布的主要地区之一[1]，根据《四川省统计年鉴，2018》粗略估算，2018年全省的农作秸秆近4 000万吨[2]，其热量值相当于2 000万吨标准煤，但目前未能被有效利用，存在露天堆弃现象严重、利用效率低的问题。如何实现天然木质纤维素资源的高效化再利用已引起全球关注。秸秆作为农作物收获籽粒后的剩余物，具有高度干化、木质纤维素含量高且结构致密的特性，难以在自然界中快速分解，进而阻碍了对其高效化、清洁化的利用进程[3]。近年来，通过定向筛选、驯化能快速分解木质纤维素的微生物菌种(菌群)成为该领域的研究热点[4-6]。

复合菌系MC1(专利编号：CN00121101.3)(以下简称“MC1”)是由崔宗均[4]等于2002年从高温堆肥样品中采用“外淘汰法”筛选出的一组纤维素分解能力强、菌种构成稳定的微生物群，在微好氧条件下静置培养8 d后，能将经碱处理的水稻秸秆分解成糊状[7]。研究表明，氧浓度对MC1分解木质纤维素的性能有重要影响[8]。另有研究表明，机械粉碎的物理预处理和酸碱化学预处理能有效提高微生物对秸秆的分解能力[9-11]。

一般认为，较小的物料粒径会增加纤维素酶与底物的接触程度，进而提高微生物的分解效率，但过度的机械粉碎会增加能耗和处理成本，而且过小的物料粒径在静置状态下可能会降低微生物培养液中的氧浓度，并对微生物分解纤维素能力产生不利影响。路鹏[8]等通过不同封口方式和培养液的深度定量调控溶氧量，研究了氧浓度对MC1分解滤纸的影响，结果表明，半透性锡箔纸封口较橡胶反口塞密封更有利于提高该菌系的分解能力；过高或过低氧浓度均不利于纤维素的分解，分解性能最佳的氧浓度范围为0.01～0.02 mg/L。在实际应用中，能否通过秸秆粒径大小调控氧浓度以保证MC1的分解性能目前还未见报道。另外，秸秆的酸碱预处理不仅增加了成本，而且会带来二次环境污染，且原料碱处理到底对MC1分解性能有多大影响目前还不清楚。

基于上述问题，本研究以水稻秸秆和MC1为试验材料，以经碱处理的稻杆为处理组，未经碱处理的为对照组，通过稻杆的粒径与培养液的空间位置关系以调控培养液中的氧浓度，定量研究粒径大小对MC1发酵体系中氧浓度及其对稻杆分解性能的影响，以期为MC1的规模化、清洁化和低成本的广泛应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻秸秆取自于四川彭州。将收获籽粒后的水稻秸秆在60 ℃烘箱中烘至恒重，剪切至15 cm保存于干燥箱中备用。水稻秸秆成分如下：可溶性物质为(22.47±0.3)%、纤维素为(40.20±1.0)%、半纤维素为(14.36±0.3)%和木质素为(21.83±0.5)%。

复合菌系MC1由中国农业大学有机废弃物资源再利用研究中心提供，将甘油菌悬液保存于-80 ℃超低温冰箱。该菌系主要由10余种微好氧和兼性厌氧的细菌构成，隶属于Bacillus(芽孢杆菌属)、Pseudoxanthomonas(假黄单胞菌属)、Bordetella(博代氏杆菌属)和Clostridium(梭菌属)。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理方法

将水稻秸秆剪切至粒径15 cm左右，然后用l%NaOH溶液浸泡24 h后用蒸馏水洗至中性[12]，与未经碱处理的水稻秸秆一并在105 ℃烘箱中烘干至恒重备用。

1.2.2 复合菌系MC1活化方法

活化培养基采用PCS液体培养基[12]：蛋白胨0.5 g，NaCl 0.5 g，CaCO30.2 g，酵母粉0.1 g，溶解于100 mL蒸馏水中，再加入0.1 g滤纸条作为唯一碳源，pH值自然，在灭菌锅中121 ℃灭菌15 min。

取低温保藏的菌悬液加入装有80 mL新鲜液体培养基的100 mL三角瓶中，接种量为5%(按体积分数计)，用双层锡箔纸封口，置于50 ℃恒温培养箱中静止培养，使溶氧量(dissolved oxygen，DO)处于0.02～0.4 mg/L的微好氧条件。待滤纸完全崩解后连续转接2～3次，取浑浊的菌悬液备用。

1.2.3 试验设计

将经碱处理和未经碱处理的稻杆分别剪至粒径为3 cm、5 cm和10 cm，使不同粒径的稻杆分别高于、浮于和低于培养液面(见图1)，共6组处理。为了便于准确测定发酵过程中氧浓度、发酵液的pH值和挥发性脂肪酸成分、减重率和木质纤维素成分，每组处理设18个重复。具体实验过程如下：在250 mL敞口三角瓶中装150 mL PCS液体培养基(液面高度为3 cm)，用秸秆作为唯一碳源，接种量为5%(按体积计)，底物秸秆的加入量为2%(按重量计)，双层锡箔纸封口后置于50 ℃恒温培养箱中静止培养20 d，每天用手摇动2～3次。由图1可知，当粒径为10 cm时，秸秆在三角瓶中呈直立或倾斜状态，仅下端部分浸入培养液；粒径为5 cm时，大部分秸秆漂浮于培养液面，少部分浸没于培养液中；粒径为3 cm时，用橡皮筋捆绑秸秆并用细铁丝固定使之浸没于培养液中，上端与培养液面持平。

注：图A、B、C的秸秆粒径分别为10 cm、5 cm和3 cm。

1.3 测定与分析方法

1.3.1 减重率测定

分解结束后，取出秸秆残余物，用3%醋酸溶液冲洗3～5次，再用清水洗3次后于105 ℃烘干，称重。减重率的计算公式如下：

r=(m1-m0)/m1×100%，

其中r表示减重率，%；m1表示秸秆的最初始质量，g;m0表示分解后的秸秆剩余物质量,g。

1.3.2 溶氧量测定

在培养过程中根据秸秆分解状态，分别在第3 d、8 d、12 d、15 d和20 d用笔式溶氧仪(DO-30型，美国CLEAN)快速深入三角瓶中测定各处理培养液的溶氧量。在分解过程中，为了尽可能减少因频繁开口对培养液中溶氧量的影响，1个重复只能使用1次，每个时间点的测定值取3个重复的平均值，共计有15个重复用于溶氧量的测定。

1.3.3 pH值和挥发性脂肪酸的测定

pH值的取样和测定方法：在培养过程中每天用笔式pH计(SX-610型，上海三信仪表厂)测定一次培养液的pH值。为了避免每天开口测定pH值对发酵体系中溶氧量的影响，每个处理取出3个重复专用于pH值测定。

挥发性脂肪酸(volatile fatty acids，VFAs)的取样和测定方法：测定时间点与溶氧量相同，每个重复测完溶氧量后，用移液枪取0.5 mL培养液用离子色谱仪(ICS-900，Thermo Fisher，美国)分析5种VFAs(甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸)的浓度。操作步骤：先将待测发酵液用冷冻离心机于5000 r/min离心5 min，吸取一定量的上清液稀释适当倍数，然后过0.22 μm有机系滤膜后进样。测定条件：色谱柱AS19 4 mm，抑制器ASRS 300，运行时间25 min，柱流速0.5 mL/min，压力200～3 000 Pa，输送速度4 mL/min，进样量10 μL；阴离子淋洗液(KOH)发生器RFC30的参数：流速1 mL/min，终浓度30 mM，淋洗液浓度3 mM，梯度洗脱时间3 min。

1.3.4 木质纤维素成分测定

发酵结束后将待测的干燥秸秆样品用高速万能粉碎机粉碎至1 mm左右，准确称取0.5 g装入专用滤袋(F57，ANKOM，美国)，用半自动纤维素分析仪(200i型，ANKOM，美国)测定，具体操作过程见仪器说明书。

1.3.5 数据处理和分析方法

原始数据用Excel软件标准化处理后，用Sigmaplot 10.0软件制图，用SPSS17.0软件进行显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 稻杆的外观形态变化

碱处理和粒径大小对MC1分解稻杆形态的变化过程有明显差异(见表1和图2)。粒径为10 cm、经碱处理的稻杆，在第3 d时培养液由初期的透明状(图2A)变为浑浊状，打开封口有明显的酸味，说明菌体已经大量繁殖，并开始产生有机酸；第5 d时浸入培养液中的稻杆下部有崩解现象，较软的稻叶几乎全部呈糊状；第8 d时浸入培养液中较硬的茎部几乎全部分解软化，液面上部稻杆随之浸入培养液并开始崩解(见图2B)，第12 d时稻杆全部呈糊状；粒径为10 cm、未经碱处理的稻杆，发生上述现象的时间延后2～3 d(见图2C-D)，直到第15 d时稻杆全部呈糊状。碱处理对粒径为5 cm和3 cm的稻杆也有上述类似现象，说明碱处理能缩短稻杆的崩解时间，但并不会影响稻杆的最终崩解程度，这可能是由于碱处理破坏了稻杆坚固的木质纤维素结构，进而增加了纤维素酶与底物的接触程度所致[13]。由表1可知，随着粒径大小的减小，稻杆浸入培养液的部分越多，MC1分解稻杆的能力越弱，当稻杆上端平于培养液面时(粒径为3 cm)，糊化程度明显降低，第20 d时仅部分稻杆被分解，这可能是由于粒径大小和培养液形成的不同空间关系会影响发酵体系中的氧浓度，而特定氧浓度条件有助于提升MC1对木质纤维素的分解能力[8]。

注：图中A、B、C、D分别代表经碱处理的第0 d、第8 d和未经碱处理的第0 d、第8 d的稻杆。

表1 稻杆在MC1分解过程中的形态变化时间和分解程度

2.2 稻杆分解过程中的氧浓度变化

不同处理稻杆在经MC1分解过程中发酵体系溶氧量的变化趋势见图3。

由图3可知，相同粒径下，碱处理与否对发酵液中溶氧量影响不大，但粒径大小对发酵液中的溶氧量有明显影响。第0 d，各处理氧浓度(0.11～0.14 mg/L)与不同处理之间没有关联性；第3 d，各处理溶氧量迅速下降至0.02～0.04 mg/L，这可能是由于随着MC1的生长繁殖和分解代谢消耗了发酵液中可溶性氧所致；第8 d，粒径为10 cm和5 cm的发酵液溶氧量维持在0.01 mg/L以上，而粒径为3 cm的发酵液溶氧量下降至0.01 mg/L以下。之前的研究表明，在氧浓度小于0.05 mg/L的微好氧条件下[12]，MC1才有分解木质纤维素的能力，且分解纤维素的最适氧浓度为0.01～0.02 mg/L[8]。这也就解释了本实验中粒径为3 cm的稻杆分解能力较差的原因：过低的氧浓度会抑制MC1分解木质纤维素的能力。

注：图中AT表示碱处理，NAT表示未经碱处理，数字3、5、10分别表示稻杆粒径为3 cm、5 cm和10 cm，下同。

在随后的分解过程中(第8～20 d)，粒径为10 cm处理的发酵液中的溶氧量始终保持在0.01～0.03 mg/L，而粒径为5 cm处理的发酵液的溶氧量也逐渐降低至0.01 mg/L以下，这说明随着MC1的生长代谢和稻杆的分解，菌群可能消耗了发酵液中的可溶性氧，同时少量浮于培养液面的秸秆开始浸入发酵液，未能通过中空的秸秆输送氧气以满足MC1对氧浓度的生长需求，因此导致了不同粒径稻杆分解程度的差异性(见表1)。上述结果表明，通过调节中空的稻杆粒径大小与培养液面的空间关系能有效控制发酵体系中的氧浓度，当稻杆高于或浮于发酵液面时，能满足MC1对溶氧量的需求并保持较高的木质纤维素分解能力，这对今后低成本利用MC1规模化分解秸秆提供了有益参考。

2.3 稻杆分解过程中的pH值变化

不同处理对MC1分解稻杆过程中的pH值影响见图4。通过pH值的动态监测，一方面可反映MC1对稻杆的分解程度，另一方面能反映分解过程中VFAs的产生情况[14-15]。由图4可知，在稻杆分解过程中，各处理发酵液的pH值均呈先降低后升高的趋势，由第20 d最低的6.2～6.4上升至7.8～8.2，pH值下降的原因可能是由发酵体系中VFAs的积累所致，而随着底物的消耗pH值逐渐上升与MC1自身具有较强的pH自我调节能力有关[16]。各处理之间pH值降低速度有明显差异：经碱处理、粒径大小为3 cm、5 cm 和10 cm的稻杆，最低pH值出现的时间随粒径的增加而提前，pH值随粒径增加而呈降低趋势，最低pH值分别出现在第8 d、7 d和4 d(见图4A)；未经碱处理的实验组中，不同粒径大小稻杆的pH值降低持续的时间也呈依次延后的趋势，但总体下降速度较碱处理的稻杆缓慢(见图4B)。上述出现pH值最低的时间与前文稻杆外观形态发生明显崩解的时间基本吻合。

图4 碱处理(A)和未经碱处理(B)的稻杆分解过程中发酵液的pH值变化

2.4 稻杆分解过程中的VFAs成分及含量

MC1分解不同处理稻杆过程中产生VFAs的定性和定量分析分别见图5和图6。由图5可知，MC1在分解经碱处理、粒径为10 cm的稻杆过程中产生的VFAs主要有甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸，虽然不同发酵时间VFAs成分有所差异，但甲酸和乙酸的浓度明显高于其他成分。课题组在利用MC1分解小麦秸秆过程发现产生的VFAs成分与稻杆的基本相同。郭鹏[16]等分析了MC1分解木薯渣产生的挥发性物质，发现有乙醇、乙酸、乙二醇、丁酸及甘油。由此可见，MC1分解不同的木质纤维素底物产生的代谢产物也不尽相同。在厌氧发酵产甲烷过程中，嗜乙酸产甲烷途径在有机物厌氧发酵中占主导地位[17]，且乙酸是嗜乙酸产甲烷的唯一前体物质，而甲酸能被产甲烷菌直接利用且能自发地生成甲烷(ΔG0=-32.6 kJ/mol)[18]。因此，在利用秸秆厌氧发酵产甲烷过程中通过MC1先对秸秆进行生物预处理有望提高原料的产甲烷效率，近年来有关研究也证实了这一点[15][19-21]。

注：1.乳酸；2.乙酸;3-丙酸；4.甲酸；5.丁酸。

从VFAs定量分析可知(见图6)，粒径为10 cm稻杆的VFAs积累量显著高于粒径为3 cm稻杆(P<0.05)。结合2.1中稻杆的分解情况，说明微好氧环境促进了发酵液中VFAs的产生。粒径为10 cm的两组处理均在8～12 d有较高的VFAs积累量(图6A-B)，且碱处理比未经碱处理的VFAs积累量高，乙酸和甲酸最高含量分别为0.95 g/L和1.87 g/L；而粒径为3 cm的两组处理在12～15 d有较高的VFAs积累量(图6C-D)。需要指出的是，各处理出现最低pH值的时间要早于VFAs最高积累量的时间，这可能是由于随着MC1的生长繁殖增强了发酵体系的缓冲能力[4]。另外，各处理VFAs在整个稻杆分解过程中均呈现出先升高后降低的趋势，说明在后期随着分解底物的减少，MC1可能分解代谢了前期积累的VFAs。因此，建议在利用MC1预处理秸秆进行厌氧发酵应用中，需要优化预处理时间，防止MC1因自身代谢而导致VFAs大幅减少，以达到发酵物料的高效转化。

图6 稻杆在分解过程中的VFAs含量变化

2.5 稻杆分解过程中的减重率及木质纤维素成分分解率

不同处理对MC1分解稻杆减重率和木质纤维素成分分解率的比较见图7。减重率能直观地说明稻杆被分解的程度[22]。由图7可知，减重率随稻杆粒径的减小而降低，且不同粒径处理之间差异显著(P<0.05)；而相同粒径的稻杆，碱处理与否对减重率的影响不显著(P>0.05)，这与前文2.2节中氧浓度的变化趋势相吻合，也进一步证实了通过稻杆粒径与发酵液面的空间关系能有效调控发酵体系中的溶氧量，最终会影响稻杆的分解程度。

MC1对稻杆中木质纤维素各成分的分解程度不尽相同(见图7)，从高到低依次为：可溶性物质、半纤维素、纤维素和木质素，且不同处理之间上述各成分(除木质素外)的分解率差异性与减重率相似。在稻杆粒径为10 cm和5 cm的处理组中，可溶性物质的分解率均能达到90%以上，其原因在于可溶性物质主要包括单糖、二糖和小分子脂肪酸等，更易被MC1分解，本文在木质纤维素厌氧发酵产甲烷体系中也发现了类似现象[23]。另外，各处理均呈现出半纤维素分解率高于纤维素分解率的规律，这可能与木质纤维素的复杂结构有关。纤维素和半纤维素空间构成上紧密相连，纤维素酶要接触到排列有序的结晶纤维素，就必须先破坏与其缠绕的无定形半纤维素聚合物，且分解纤维素的酶系要比分解半纤维素酶系复杂[23-24]。各处理的木质素分解率仅为5%左右，且没有差异性(P>0.05)，说明MC1对稻杆中木质素的分解能力较弱，这与前人研究结果一致[5][7][16]。

图7 不同处理稻杆的减重率和木质纤维素成分分解率比较

3 结论

(a)通过控制稻杆粒径大小与复合菌系MC1培养液面的空间关系，可有效调节发酵液中氧浓度保持在微好氧范围内(0.01～0.04 mg/L)，进而维持MC1对稻杆的高分解率。

(b)对于相同粒径的稻杆，虽然碱处理能加快MC1对稻杆的分解速率，但碱处理与否对其最终分解程度影响不大。另外，由于碱处理会提高预处理成本，并可能产生二次污染，因此在实际应用中采用碱处理秸秆并无明显优势。

(c)在MC1分解稻杆产生的VFAs中，主要以甲酸和乙酸为主，这对利用MC1预处理秸秆高效产甲烷具有实际指导意义。

(d)粒径为10 cm(高于培养液面)稻杆的减重率和木质纤维素成分的分解率显著高于粒径为5 cm(浮于培养液面)和3 cm(低于培养液面)的稻杆，这对通过减少机械粉碎能耗而实现低成本的MC1高效分解天然木质纤维素提供了依据。