青藤碱通过miR-23b-3p/FGF9诱导人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞凋亡*

李 嘉， 付婷婷， 张光峰， 刘向前， 陈 民△

（广东省人民医院 1正骨科，2中医科，3风湿科，广东广州510080）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫病，以滑膜异常增生、滑膜炎和关节外病变为主要特征，成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblastlike synoviocytes，FLS）的过度增殖和凋亡不足是导致滑膜炎和骨破坏的重要原因［1］。因此，抑制滑膜细胞增殖、诱导滑膜细胞凋亡是治疗RA的重要途径之一。研究发现中药及其有效成分可影响类风湿关节炎滑膜细胞增殖和凋亡，可为治疗RA提供新途径［2］。

青藤碱（sinomenine，SIN）是从传统中药青风藤中提取的碱类单体，具有免疫抑制和抗炎作用，治疗RA效果较好［3］。SIN可通过降低关节滑漠中炎症因子的表达改善RA发病进展和患者生存质量［4］。SIN可防止软骨和软骨下骨破坏造成的关节畸形［5］。SIN还能抑制滑膜细胞异常增殖，诱导其凋亡［6］。然而SIN对RA FLS增殖和凋亡的分子机制尚不清楚。

微小RNA-23b-3p（microRNA-23b-3p，miR-23b-3p）通过靶向X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）可抑制RA FLS增殖，促进其凋亡［7］。miR-23b可抑制与白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）相关的自身免疫炎症［8］。成纤维细胞生长因子9（fibroblast growth factor 9，FGF9）是成纤维细胞生长因子家族的成员之一，可促进破骨前体细胞向破骨细胞的分化，影响骨质疏松［9］。FGF9是成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）的特异性配体，可激活激活FGFR3；而FGFR3信号的激活可减缓骨性关节炎中关节软骨损伤的进程［10］。本实验旨在研究SIN对RA FLS增殖和凋亡的影响及其分子机制是否与miR-23b-3p和FGF9有关。

材料和方法

1 滑膜标本采集

本实验用滑膜标本取自本院2017年1月～2019年1月行关节镜滑膜切除的RA患者关节内滑膜组织，患者诊断症状符合美国风湿协会1987年类风湿关节炎的诊断标准；所取关节内滑膜组织的患者均同意取其滑膜组织，且同意用于本研究，并签署了知情同意书。

2 主要试剂与药品

SIN（纯度≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自上海如吉生物科技发展有限公司；胎牛血清和DMEM高糖培养基购自HyClone；CCK-8、凋亡检测试剂盒和双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝公司；抗FGF9、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2及β-actin单抗购自上海煊翎生物科技有限公司；羊抗兔IgG-HRP购自上海恒斐生物科技有限公司；Trizol试剂和荧光定量试剂盒购自上海百研生物科技有限公司。

3 主要仪器

CO2细胞培养箱（Precision Scientific）；LightCycler 480荧光定量PCR仪（Roche）；酶标仪（Thermo）；FACSCalibur流式细胞仪、PowerPac蛋白电泳仪及Gel Doc XR+凝胶显示系统（Bio-Rad）。

4 方法

4.1 人RA FLS的分离培养与鉴定 无菌条件下将类风湿关节炎滑膜组织除去多余组织，磷酸盐冲洗后剪碎，用胰酶和胶原酶消化后在含10%胎牛血清的DMEM培养液中进行传代培养，取第3代细胞进行鉴定，将RA FLS接种在6孔细胞板，细胞生长至80%左右时用4%多聚甲醛固定，再用0.5%Triton X-100室温通透20 min，封闭液封闭1 h，加入I抗4℃孵育过夜，加入II抗孵育1 h。DAPI染色后封片，干燥后显微镜下观察细胞形态，细胞呈长梭形，胞核卵圆居中，符合FLS形态。取4～6代细胞用于后续实验。

4.2 细胞处理与分组 用100 mg/L的LPS处理RA FLS记为LPS组；3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同处理细胞，记为LPS+SIN组；不作任何处理的细胞作为空白（blank）组。将miR-con、miR-23b-3p、si-con和si-FGF9转染至RA FLS中再用100 mg/L LPS处理，分别记为LPS+miR-con组、LPS+miR-23b-3p组、LPS+si-con组和LPS+si-FGF9组；将anti-miR-con、anti-miR-23b-3p、pcDNA和 pcDNA-FGF9转染至 RA FLS中，再用3.2 mmol/L SIN和100 mg/L LPS共同处理，分别记为LPS+SIN+anti-miR-con组、LPS+SIN+anti-miR-23b-3p组、LPS+SIN+pcDNA组和LPS+SIN+pcDNA-FGF9组。

4.3 CCK-8法检测细胞活力 选择各组转染后培养48 h的细胞，每孔中加入10µL CCK-8试剂，孵育2 h后，酶标仪检测490 nm处吸光度（A）值。细胞相对活力（%）=实验组A值/空白对照组A值×100%。实验重复3次。

4.4 集落形成实验 取对数生长期细胞，制成1×107/L细胞悬液，以每孔100个细胞接种于6孔板中，每组设3个复孔，培养2周出现肉眼可见细胞集落时终止培养，PBS清洗2遍，甲醇固定15 min，吉姆萨染色30 min，在低倍光学显微镜下计数＞50个细胞的集落。

4.5 Western blot法检测 FGF9、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平 各组细胞培养48 h后提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。将蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，再分别加入I抗（1∶1 000），4℃孵育过夜；加入II抗（1∶2 000）室温孵育90 min，ECL发光液显影，ChemiDoc XRS+系统成像，用Quantity One凝胶分析软件测定蛋白条带灰度值。蛋白相对表达水平=目的条带灰度值/β-actin条带灰度值。每个蛋白样品设3个重复。

4.6 流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞培养48 h后用预冷的PBS漂洗2次，与500µL的结合缓冲液混匀。先加入10µL的annexin V-FITC，再加入5µL的PI，混匀后避光孵育10 min。用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组设3个复孔，实验重复3次。

4.7 RT-qPCR检测miR-23b-3p和FGF9 mRNA的表达水平 各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA，反转录成cDNA，miR-23b-3p和FGF9分别以U6和GAPDH为内参照进行PCR扩增，每个样品重复3次。循环条件为95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。miR-23b-3p的上游引物序列为5'-CACAAAGGCATCTCTACGCCCATC-3'，下游引物序列为5'-TGTAGCTGCC TCGCCAGAGGC-3'；U6的上游引物序列为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列为5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；FGF9的上游引物序列为5'-AAGGACTGCGGCCTGATG-3'，下游引物序列为5'-TTTGCTTTAAGTTCA CTGCGATG-3'；GAPDH的上游引物序列为5'-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3'，下游引物序列为5'-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3'。目的基因的相对表达量采用 2-ΔΔCt法计算。

4.8 双萤光素酶报告基因实验验证miR-23b-3p和FGF9的靶向关系 构建包含miR-23b-3p结合位点的FGF9 3'UTR野生型和突变型萤光素酶载体（WTFGF9和 MUT-FGF9），将其与 miR-con、miR-23b-3p、anti-miR-con或anti-miR-23b-3p共转染至RA FLS中，转染48 h后，检测萤光素酶相对活性。

5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni校正的t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SIN抑制LPS诱导的人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖

与空白组相比，LPS组的细胞活力升高，细胞集落形成数增多（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+SIN组细胞活力降低，细胞集落形成数减少（P＜0.05），见表1。

表1 青藤碱对LPS诱导的人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞活力和集落形成的影响Table 1.The effects of sinomenine（SIN）on the viability and colony formation of human rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocytes induced by LPS（Mean±SD.n=9）

2 SIN促进LPS诱导的人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞凋亡

与空白组相比，LPS组cleaved caspase-3和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+SIN组cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平降低，细胞凋亡率升高（P＜0.05），见图1。

3 SIN对LPS诱导的人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞miR-23b-3p和FGF9表达的影响

与空白组相比，LPS组miR-23b-3p的表达水平降低，FGF9的mRNA和蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与LPS组相比，LPS+SIN组的miR-23b-3p表达水平升高，FGF9的mRNA和蛋白表达水平降低（P＜0.05），见图2。

Figure 1 The effects of sinomenine（SIN）on human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte apoptosis and expression of cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 proteins induced by LPS.A：Western blot was used to determine the protein levels of cleaved caspase-3，Bax，and Bcl-2 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs blank group；#P＜0.05 vs LPS group.图1 青藤碱对LPS诱导人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞凋亡和cleaved caspase-3、Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

Figure 2.The effects of sinomenine（SIN）on the expression of miR-23b-3p，FGF9 mRNA and FGF9 protein in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes induced by LPS.A，B：RT-qPCR was used to determine the expression of miR-23b-3p and FGF9 mRNA in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；C：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs blank group；#P＜0.05 vs LPS group.图2 青藤碱对LPS诱导人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞miR-23b-3p、FGF9 mRNA及FGF9蛋白表达的影响

4 miR-23b-3p靶向调控FGF9的表达

TargetScan预测显示miR-23b-3p与FGF9存在结合位点（图3A）。萤光素酶报告基因实验显示，与miR-con组相比，miR-23b-3p组转染WT-FGF9载体的细胞萤光素酶活性显著降低（P＜0.05）；与antimiR-con组相比，anti-miR-23b-3p组转染WT-FGF9载体的细胞萤光素酶活性显著升高（P＜0.05）；各组转染MUT-FGF9载体的细胞萤光素酶活性无显著差异，见图3B。与miR-con组相比，miR-23b-3p组FGF9表达水平显著降低（P＜0.05）；与anti-miR-con组相比，anti-miR-23b-3p组FGF9表达水平显著升高（P＜0.05），见图3C。

5 转染miR-23b-3p或沉默FGF9抑制LPS诱导的人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖并促进凋亡

Figure 3.Targeted binding site of miR-23b-3p to FGF9 3'UTR（A），dual-luciferase reporter assay results（B）and Western blot to determine the protein expression of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes（C）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs miR-con group；#P＜0.05 vs anti-miR-con group.图3 miR-23b-3p与FGF9 3'UTR存在靶向结合位点、双萤光素酶报告基因实验结果和Western blot检测人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞FGF9蛋白的表达

与LPS+miR-con组相比，LPS+miR-23b-3p组miR-23b-3p表达水平升高，FGF9表达水平降低，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2表达水平降低，细胞活力降低，细胞集落形成数减少，细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与LPS+si-con组相比，LPS+si-FGF9组FGF9表达水平降低，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平升高，Bcl-2表达水平降低，细胞活力降低，细胞集落形成数减少，细胞凋亡率升高（P＜0.05），见图4。

6 干扰miR-23b-3p或过表达FGF9抑制LPS诱导的人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖和促进凋亡

与LPS+SIN+anti-miR-con组相比，LPS+SIN+anti-miR-23b-3p组的miR-23b-3p表达水平降低，FGF9的表达水平升高，cleaved caspase-3和Bax蛋白水平降低，Bcl-2蛋白水平升高，细胞活力升高，细胞集落形成数升高，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与LPS+SIN+pcDNA组相比，LPS+SIN+pcDNA-FGF9组FGF9的表达水平升高，cleaved caspase-3和Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，细胞活力升高，细胞集落形成数升高，细胞凋亡率降低（P＜0.05），见图5。

讨 论

RA是一种常见的风湿性疾病，其致残率高，严重影响患者生活质量，中医药治疗RA疗效好，安全性高，具有一定优势［11］。RAFLS是滑膜细胞的主要组成成分，在RA的发生发展中起重要作用［12］。已有研究表明SIN可降低RA患者体内炎症因子，改善患者临床症状，具有治疗RA的作用［13］。SIN联合甲氨蝶呤对RA FLS具有协同抑制作用，抑制RA骨破坏［14］。本实验通过用LPS处理RA FLS模拟其在体内环境，用SIN作用LPS处理的RA FLS，结果显示，细胞活力降低，细胞集落形成数减少，cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平升高，Bcl-2的蛋白水平降低，细胞凋亡率升高，表明SIN可抑制RA FLS增殖，并促进细胞凋亡。

miRNA是一类保守的非编码单链小分子RNA，能够在转录后水平调节mRNA表达导致蛋白翻译抑制或促进靶mRNA降解，miRNA与关节炎滑膜细胞异常增殖的发生发展过程相关［15］。研究报道miR-23b-3p可抑制RAFLS增殖，促进其凋亡［7］。研究还发现抗肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）/疾病修饰抗风湿药联合治疗RA患者血清中的miR-23-3p上调表达，其作为抗TNF-α治疗的类风湿关节炎患者治疗效果的潜在生物标志物［16］。miR-23b-3p下调通过增加Bax和caspase-3的表达显著抑制白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）诱导的CHON-001细胞凋亡［17］。miR-23b-3p在心房成纤维细胞通过靶向转化生长因子β III型受体（transforming growth factor-beta III receptor，TGFBR3）增强与纤维化相关基因的表达［18］。本实验结果显示，过表达miR-23b-3p后，cleaved caspase-3和Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，细胞活力降低，细胞集落形成数降低，细胞凋亡率升高，说明过表达miR-23b-3p可抑制RAFLS增殖，促进LPS诱导的细胞凋亡。本研究还发现SIN处理的RA FLS中miR-23b-3p表达水平升高，说明SIN可上调miR-23b-3p表达。且干扰miR-23b-3p逆转了SIN对LPS诱导的RA FLS增殖和凋亡的影响，提示，SIN可能通过上调miR-23b-3p影响RA FLS增殖和凋亡。

Figure 4.The effects of transfection with miR-23b-3p or silencing of FGF9 on LPS-induced human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cell proliferation，apoptosis，and cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 protein levels.A：RT-qPCR was used to determine the expression level of miR-23b-3p in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：MTT detection of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte viability；C：colony formation test to detect the number of colonies；D：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；E，F：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs LPS+miR-con group；#P＜0.05 vs LPS+si-con group.图4 转染miR-23b-3p或沉默FGF9对LPS诱导的人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖、凋亡及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影响

研究报道FGF9在RA组织中高表达，参与RA关节破坏的发病［19］。miR-4317通过靶向FGF9抑制非小细胞肺癌增殖和集落形成［20］。miR-372-3p通过靶向FGF9促进肺鳞状细胞癌中的细胞生长和转移［21］。本实验结果显示，沉默FGF9抑制LPS诱导的RA FLS增殖并增加细胞凋亡。SIN处理的RAFLS中FGF9下调表达，且过表达FGF9逆转了SIN对LPS诱导的RA FLS增殖和凋亡的影响，说明SIN影响RA FLS增殖和凋亡可能与FGF9表达有关。且本实验还发现miR-23b-3p靶向负调控FGF9，提示SIN可能通过调控miR-23b-3p影响FGF9的表达进而影响RA FLS的增殖和凋亡。

综上所述，SIN可通过miR-23b-3p/FGF9信号通路促进LPS诱导的RA FLS凋亡，抑制细胞增殖。

Figure 5.The effects of transfection of miR-23b-3p or overexpression of FGF9 on LPS-induced human rheumatoid arthritis fibroblastlike synoviocyte proliferation，apoptosis，and cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 protein levels.A：RT-qPCR was used to determine the expression level of miR-23b-3p in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；B：MTT detection of human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte viability；C：colony formation test to detect the number of colonies；D：Western blot was used to determine the protein level of FGF9 in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells；E，F：flow cytometry was used to analyze the apoptosis.Mean±SD.n=9.*P＜0.05 vs LPS+SIN+anti-miR-con group；#P＜0.05 vs LPS+SIN+pcDNA group.图5 转染miR-23b-3p或过表达FGF9对LPS诱导的人类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞增殖、凋亡及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白水平的影响