亚麻木酚素通过抑制TXNIP和激活NLRP3炎症小体减轻慢性间歇性低氧小鼠肾脏炎症损伤*

刘 寒， 郭亚净， 赵亚硕， 任 静， 周 健， 吉恩生

（河北中医学院科研中心，河北石家庄050200）

阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnea，OSA）是一种常见的睡眠呼吸障碍性疾病，以慢性间歇性低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）为主要特征，患病率较高，在肥胖人群中高达70%，且临床数据显示不同年龄阶段男性的患病率均高于女性［1］。其主要表现为睡眠期间反复发生上呼吸道的部分或完全阻塞，导致睡眠片段化、低氧血症和高碳酸血症［2］。流行病学调查发现，过去20年间未经治疗的OSA患者患晚期肾脏疾病的风险显著增加［2-3］。更有临床数据证实，患有慢性肾病的患者多伴发失眠和呼吸障碍性疾病［4］。并且有学者提出长期的CIH会造成机体氧化应激、慢性炎症和代谢紊乱。

硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）［5］是机体调节氧化应激的重要成员，在各种病原刺激下（如LPS、病毒、氧化应激等）与硫氧还蛋白1（thioredoxin-1，TRX-1）解离，并与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）结合从而激活NLRP3炎症小体，促进炎症因子白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18的释放，导致炎症发生。

近年来，亚麻籽因含有的某些生物活性成分如可溶性膳食纤维、木酚素和α-亚麻酸所带来的健康效益而受到广泛的关注。亚麻籽中含量最高且最主要的是亚麻木酚素（flax lignan）［6］，又称为开环异落叶松脂素二葡萄糖苷（secoisolariciresinol diglucoside，SDG），是良好的天然抗氧化剂，具有多方面的药理活性，包括抗炎、抗肿瘤、预防心血管疾病、预防骨质疏松和糖尿病等。本研究以SDG的抗氧化、抗炎作用为出发点探讨其是否可以减轻CIH引起的肾脏炎症损伤及其潜在的机制研究。

材料和方法

1 动物

SPF级C57BL/6N小鼠30只，雄性，6～8周龄，18～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2016-0006。动物饲料和垫料购自江苏协同医药生物工程股份有限公司。

2 主要仪器与试剂

2.1 主要仪器 动物CIH装置（Oxycycler Model 84）购自BioSpherix；多功能成像系统Fusion FX5 Spectra购自VIBER LOURMAT；多功能微孔板读数仪Varioskan LUX购自Thermo Fisher；显微拍照系统购自Leica；全自动生化分析仪Chemray 240购自深圳雷杜生命科技有限公司。

2.2 主要药品与试剂 SDG购自爱必信生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒（批号A001-1-2）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（批号A003-1-2）购自南京建成生物工程研究所；抗NLRP3抗体、抗含CARD的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）抗体、抗caspase-1抗体、抗IL-1β和抗IL-18抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；抗TXNIP抗体购自Proteintech；RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF）购自北京索莱宝科技有限公司；Tween-20和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自武汉塞维尔生物科技有限公司；炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β ELISA检测试剂盒购自Invitrogen。

3 主要方法

3.1 动物模型的建立及分组 将C57BL/6N小鼠适应性喂养1周后分为3组：正常（control）组、模型（CIH）组和治疗（SDG）组，每组10只。SDG在临用前用生理盐水配成混悬液，连续给药35 d（30 mg/kg，根据药理实验方法学，通过临床人用药量折算小鼠用药量），另外2组给予等量生理盐水。分别在小鼠上舱0.5 h前以灌胃方式给予。将模型组和治疗组放置于间歇性低氧舱内，每天持续时间8 h（8：00～16：00），共持续35 d，低氧舱程序设计为每一低氧复氧循环时间为3 min，前1.5 min充入100%N2使氧气浓度降至9%，后1.5 min充入O2使氧气浓度恢复到21%，如此循环，模拟中重度OSA。

3.2 标本的采集 动物模型建立完成，各组小鼠禁食不禁水12h后，称重。用1%的戊巴比妥钠麻醉，眼球摘除取血，分离血清，置-80℃冰箱保存备用。打开腹腔，迅速摘取肾脏，在冰板上去除肾表面的被膜并称重。左肾放入4%多聚甲醛溶液中，以备后续的石蜡切片，剩余组织保存于-80℃冰箱。

3.3 肾功能指标的检测 应用全自动生化分析仪检测血清肌酐（serum creatinine，SCr）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量。

3.4 组织标本的处理和指标的检测 将在4%多聚甲醛中固定的肾脏组织经梯度乙醇脱水后进行石蜡包埋，切片机进行切片，厚度为5µm，苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察肾小球和肾小管形态变化；免疫组织化学染色检测肾脏组织中NLRP3和TXNIP的蛋白表达情况，利用Image-Pro Plus 6.0对图像进行吸光度分析。

3.5 相关炎症因子和抗氧化指标的检测 ELISA法测定小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，具体步骤按试剂盒说明书操作，终止后使用酶标仪450nm波长上读出各孔吸光度（A）值，并根据试剂盒提供的标准品制作标准曲线，计算各组小鼠血清中炎症因子的含量。羟胺法和硫代巴比妥酸法检测肾组织SOD的活性和MDA的含量，具体步骤根据南京建成MDA测试盒和SOD测试盒说明书进行，分析肾脏组织氧化程度。

3.6 Western blot检测肾脏组织中相关蛋白的表达 称取小鼠肾脏组织30 mg左右，每10 mg组织加入已预冷的RIPA裂解液100µL，置于冰上15 min，随后用组织破碎仪进行破碎，4℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清，用BCA法测定蛋白浓度，最后通过Western blot检测肾脏组织中TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白水平。

4 统计学处理

用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用Tukey's法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CIH对小鼠肾脏指数的影响

与正常组相比，模型组小鼠体重和肾脏指数的差异无统计学显著性；与模型组相比，SDG治疗组（以下简称治疗组）的小鼠体重和肾脏指数的差异也无统计学显著性（P＞0.05），由此说明，CIH对小鼠体重无影响，见表1。

2 CIH对小鼠肾功能的影响

与正常组相比，模型组小鼠SCr水平有显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且经过治疗后，有所好转；BUN水平变化不显著，差异无统计学显著性（P＞0.05），见表1。

表1 各组小鼠肾重、体重、肾脏指数、血尿素氮和血清肌酐的比较Table 1.The comparison of renal weight，body weight，ratio of renal weight to body weight（n=6），and blood urea nitrogen（BUN）and serum creatinine（SCr）of the mice（n=4）in each group（Mean±SD）

3 SDG减轻CIH小鼠的肾脏病理损伤

3.1 肾脏解剖观察 将小鼠腹腔打开，仔细观察小鼠肾脏大小、形态、颜色。正常组、模型组和治疗组的肾脏大小基本一致，表面光滑、无肿胀、无出血，无明显差异，模型组肾脏颜色较正常组颜色加深，其他变化不明显，见图1。

3.2 肾脏病理学观察 HE染色显示正常组小鼠肾小球、肾小管形状规则，肾小管上皮细胞排列整齐，形态完整，细胞质均匀；模型组肾小球内皮细胞变性坏死（箭头所示），肾小管上皮细胞中出现大小不等的空泡，少量肾小管上皮细胞坏死、脱落；治疗组肾小球形态正常，少量肾小管上皮细胞变性坏死，见图2。

Figure 1.The macroscopic changes of renal tissues.图1 肾脏大体观察

Figure 2.HE staining for observing the pathological changes of renal tissues.The scale bar=12.5µm.图2 肾脏组织HE染色观察

4 SDG减轻CIH小鼠的肾脏炎症损伤

4.1 ELISA检测血清中促炎因子的水平 与正常组相比，模型组小鼠血清中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量显著升高，治疗组血清中TNF-α和IL-1β的含量较模型组显著下降（P＜0.05），见表2。

表2 各组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平及肾脏组织SOD活性和MDA含量的测定Table 2.The serum levels of inflammatory factors，and the activity of SOD and the content of MDA in the renal tissues of each group（Mean±SD.n=4）

4.2 免疫组织化学染色检测肾组织NLRP3蛋白的表达水平 NLRP3蛋白主要表达在肾小管上皮细胞胞浆内，且积分吸光度（integral absorbance，IA）统计结果显示，与正常组相比，模型组NLRP3蛋白的表达量显著增多（P＜0.05），与模型组相比，治疗组NLRP3蛋白表达减少（P＜0.05），说明SDG具有良好的治疗作用，见图3。

4.3 Western blot检测肾组织NLRP3炎症小体和炎症因子的蛋白水平 与正常组相比，模型组NLRP3炎症小体相关蛋白NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白上调，其活化标志物IL-1β和IL-18的表达上调，治疗组比模型组显著降低（P＜0.05），说明SDG可抑制炎症小体的生成和炎症因子的表达，见图4。

5 SDG可抑制CIH小鼠肾组织氧化应激

5.1 羟胺法和硫代巴比妥酸法分别检测SOD的活性和MDA的含量 与正常组相比，模型组MDA的含量增高，模型组SOD的活性较正常组降低（P＜0.05），给予SDG治疗后，这2项指标有所恢复，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

5.2 免疫组织化学染色检测肾组织TXNIP蛋白的表达量 TXNIP在正常组细胞胞浆内表达很少，当受到刺激后，模型组细胞胞浆内明显增多，且免疫组化IA统计结果显示，治疗组胞浆内TXNIP表达低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

5.3 Western blot检测肾组织TXNIP蛋白的表达量 与正常组相比，模型组TXNIP蛋白表达显著增多（P＜0.05），治疗组与模型组相比显著减少（P＜0.05），见图6。

上述结果说明SDG可降低MDA水平，提高SOD活性，减少TXNIP表达，从而抑制氧化应激。

Figure 3 The representative images of immunohistochemical staining for NLRP3 in each group and the analysis of integral absorbance（IA）.The scale bar=50 µm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.图3 各组小鼠肾脏组织NLRP3蛋白免疫组织化学染色结果

Figure 4.The protein expression of NLRP3，caspase-1，ASC，IL-18 and IL-1β in each group was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.图4 各组小鼠肾脏组织中NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β蛋白表达水平

讨 论

Figure 5.The representative images of immunohistochemical staining for TXNIP in each group and the analysis of integral absorbance（IA）.The scale bar=100 µm.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.图5 各组小鼠肾脏组织中TXNIP的免疫组织化学染色结果

Figure 6.The protein expression of TXNIP in each group was determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs CIH group.图6 各组小鼠肾脏组织中TXNIP蛋白的测定

阻塞性睡眠呼吸暂停在临床中最常见和最典型的症状是出现上呼吸道的部分或完全阻塞，从而表现出间歇性低氧的情况，因此有效的缓解间歇性低氧是治疗OSA的重中之重。本研究通过建立间歇性低氧模型来模拟中重度OSA，从动物水平研究SDG对CIH模型小鼠肾脏炎症损伤的作用机制，为OSA的治疗提供更有利的理论依据。CIH作为OSA的主要病理特征，可以引起生物体的氧化应激，造成活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的产生，最终导致OSA病人心、肾等器官的功能损害［7-10］，临床主要表现为夜间尿量增多、肾功能低下，病理表现为肾小球结构改变、肾小管上皮细胞脱落、坏死，严重者有炎症细胞浸润，肾脏纤维化。本研究CIH组的肾脏病理变化明显，肾小球结构紊乱，肾小管上皮细胞脱落，甚至坏死，与李婷等［9］研究的结果一致，都是由于长时间的间歇性低氧导致细胞发生氧化应激造成的。李娟芝等［11］的研究已证实，在动物体内，CIH引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的激活，参与足细胞损伤、系膜细胞损伤、肾小管上皮细胞损伤及肾脏纤维化，而抑制ERS的激活可以保护肾脏。Salminen等［12］发现，动物心、肾等器官发生缺血再灌注损伤时，线粒体电子传递复合体及氮氧化物酶等会产生大量的ROS，造成机体损伤，而应用线粒体特异性的ROS抑制剂，可有效缓解心、肾等脏器缺血再灌注所造成的损伤。也有研究发现，间歇性低氧动物心肌组织中丙二醛水平显著增加，且超氧化物歧化酶活性显著降低。MDA是脂质过氧化作用的主要产物之一，能够反映脂质过氧化作用的水平。SOD能清除超氧化自由基，防止细胞损伤，它的活性可以直接反映细胞对氧自由基的清除能力，在维持组织细胞氧化和抗氧化平衡中起关键作用［13-14］。本研究通过羟胺法测定CIH小鼠肾脏组织SOD活性，发现SOD活性下降，表明肾组织细胞清除氧自由基能力下降。同时通过TBA法检测肾脏组织MDA的含量，发现MDA含量增高，说明肾脏组织细胞发生了过氧化，间接反映间歇性低氧诱导了肾组织的氧化应激，造成肾脏损伤。

TXNIP是硫氧还蛋白系统中的一员，在正常情况下，TXNIP与氧化型TRX-1结合抵抗组织细胞氧化应激，而当机体受到外界病原的氧化刺激，活性氧ROS增多，TRX-1蛋白被还原，由于TRX-1蛋白本身可形成二硫键，随即与TXNIP解离，促使TXNIP与NLRP3结合，从而激活NLRP3炎症小体，进一步活化下游信号通路，促进炎症因子IL-1β和IL-18的成熟与释放［15］。NLRP3炎症小体是机体固有免疫系统的重要组成，由模式识别受体NLRP3、ASC及caspase-1组成［16-17］。当机体受到内源或外源性刺激（如细菌毒素、病毒基因组、氧化应激等）时，NLRP3炎症小体被激活，进而活化下游信号通路，引起机体炎症反应。在本研究中，由于间接性低氧引起的氧化应激促使TXNIP与TRX-1解离，与NLRP3结合，进而激活NLRP3炎症小体，促进IL-18和IL-1β的成熟与释放，造成肾脏炎症损伤。本文通过蛋白免疫印迹实验得出CIH组中TXNIP和NLRP3的蛋白表达量显著身高，炎症因子大量产生，符合间歇性低氧的特征。所以抑制氧化应激的药物可能具有治疗特定炎症性疾病的潜力。

亚麻籽是亚麻科（Linaceae）亚麻属（Linum）草本植物亚麻的成熟种子，其成分主要包括木酚素、油脂、蛋白质、矿物质、亚麻籽胶、维生素等［18］，其中，含量最高且最主要的是木酚素，其具有抗氧化、抗肿瘤、保护心血管、增强机体免疫力、调节脂质代谢和延缓衰老等作用，对人类健康有重要意义。作为天然的抗氧化剂，在医药方面取得很大的突破。Prasad等［19］研究发现对已形成AS的新西兰兔模型中，SDG可显著降低主动脉MDA水平，减少主动脉内膜斑块形成面积。Dupasquier等［20］研究表明，膳食中添加5%的亚麻籽能够显著抑制低密度脂蛋白受体缺失小鼠动脉粥样斑块的形成。王荣等［6］研究表明SDG对自由基引发剂AAPH诱导的红细胞和肝组织氧化损伤有拮抗作用，其作用机制可能是通过保护红细胞和肝组织内抗氧化酶和抑制脂质过氧化实现的。由于木酚素独特的生物活性和多方面的药理作用，其在炎症和肿瘤疾病中也取得一些进展。Teponno等［21］等的研究发现在食物中添加5%SDG能显著抑制巨噬细胞标志物MAC-3以及炎症因子IL-6和VCAM-1的表达。Zanwar等［22］制备的大鼠心肌坏死模型研究表明，SDG能显著减轻心肌炎症。2017年美国国立卫生研究院批准的一项研究显示，SDG能减少石棉诱导的肺癌细胞的NLRP3炎症小体的表达和NF-κB的激活，再次证明SDG有明显的抑炎作用。本研究结果显示，CIH引起机体产生过量的活性氧或自由基，造成肾脏发生氧化损伤，肾组织NLRP3、ASC、IL-18和IL-1β蛋白，以及血清中炎症因子IL-6、TNF-α等表达显著升高，发生炎症反应；当给予SDG治疗后，肾脏组织的抗氧化作用增强，病理炎症反应减轻，肾脏损伤明显减轻。临床OSA病人的发病原因和机制非常复杂，涉及多种反应，炎症在其中发挥着重要作用，长期炎症环境下可使组织细胞损伤，诱导其死亡。本研究得出由于CIH所造成肾脏发生炎症损伤的作用机制可能与TXNIP-NLRP3信号通路有关。

综上所述，SDG能有效减轻CIH小鼠肾脏炎症损伤，其作用机制与抗氧化、抑制炎症有关。本研究为临床治疗OSA提供了新的思路。