组蛋白伴侣ASF1B在前列腺癌细胞的表达及其对体外细胞活力的影响*

蔡江怡， 朱乐乐

（1温州市中西医结合医院泌尿外科，2温州市中医院病理科，浙江温州25000）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性中常见的恶性肿瘤之一［1］。目前，PCa的治疗效果并不令人满意，PCa远处转移患者的5年生存率仅为20%［2］。因此，有必要开发一种安全有效的PCa治疗靶点［3］。抗沉默功能蛋白1（anti-silencing function 1，ASF1）最初在酵母中被鉴定，属于组蛋白H3-H4伴侣蛋白［4］。ASF1具有调节染色质功能，并已被证明有助于肿瘤发生。ASF1有2个主要的亚型，分别是ASF1A和ASF1B［5］。研究报道，ASF1B在人胸腺和睾丸中高表达［6］。此外，据报道ASF1B参与了宫颈癌和乳腺癌的发展［7］。然而，ASF1B在PCa中的作用仍不清楚。因此，本项工作应用细胞体外实验，探讨ASF1B在前列腺癌细胞中的表达情况及其对体外细胞增殖能力的影响。

材料和方法

1 细胞培养

人前列腺增生上皮细胞系（良性前列腺增生，benign prostatic hyperplasia，BPH）和前列腺癌PC-3细胞购自ATCC。BPH细胞在含10%胎牛血清（Thermo Fisher Scientifc）、1×105U/L青霉素和 100 mg/L链霉素（Sigma-Aldrich）的DMEM培养液（北京索莱宝科技有限公司）中培养。PC-3细胞在含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI-1640培养液（北京索莱宝科技有限公司）中培养。将所有细胞保持在含有5%CO2的37℃加湿培养箱中。

2 方法

2.1 RNA干扰、转染与分组 用经过验证的特异性siRNA进行ASF1B的敲减，siRNA-ASF1B（购自Thermo Fisher Scientific）的正义链序列为5'-ACGCAACCCTGTCAGTCTG-3'，反义链序列为5'-GGGCAGGTCCACCATTTCC-3'。使用非特异性杂乱siRNA载体作为对照，其正义链序列为5'-AGCAGCTAGAATCCCTGGG-3'，反义链序列为5'-AGGCCGAAGGAGTTCCAGT-3'。将PC-3细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到6孔板中，分为对照（control，Con）组、siRNA阴性对照载体（mock）组和 siRNAASF1B组。对照组不做任何处理；mock组使用Hieff TransTM脂质体转染试剂（Sigma-Aldrich）和siRNA阴性对照载体（1µg）转染细胞；siRNA-ASF1B组使用Hieff TransTM脂质体转染试剂和siRNAASF1B（1µg）转染细胞。将细胞在37℃下孵育12 h，随后收集细胞并进行Western blot、RT-qPCR和MTT实验。

2.2 细胞活力测定 通过MTT法测定细胞活力。将上述处理细胞（1×108/L）接种到96孔培养板中，孵育过夜后，然后向每个孔中加入10µL MTT溶液（在PBS中2.5 g/L），并将板在37℃下再温育4 h。离心（2 000×g，10 min）后，吸出含有MTT的培养液，然后加入100µL DMSO。用SynergyHT多功能酶标仪（Winooski）在570 nm下测量每个孔的吸光度（A）值。

2.3 Western blot分析 收集细胞在RIPA裂解物缓冲液中裂解，并在冰上进行温和超声处理。在BCA定量后，向每个泳道中加入20µg细胞裂解物，随后通过8%SDS-PAGE（30 mA，120 min）分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与I抗［兔抗AKT（1∶800稀释）、兔抗p-AKT（1∶500稀释）、兔抗pMAP2K4（1∶1 000稀释）、兔抗p-ERK（1∶1 000稀释）、兔抗ERK（1∶1 000稀释）、兔抗JNK（1∶1 000稀释）、兔抗p-JNK（1∶1 000稀释）和兔抗β-actin（1∶1 000稀释），均购自Cell Signaling Technology］在4℃温育过夜，然后与抗生物素蛋白-生物素化的辣根过氧化物酶复合物II抗在室温下温育2 h。使用Image Lab 5.0软件（Bio-Rad Laboratories）定量靶蛋白和β-actin的条带强度，并将每种靶蛋白的强度标准化为相应的β-actin水平。

2.4 RT-qPCR分析 使用RNA提取试剂盒（Promega）提取细胞的总RNA。使用TianScript cDNA Synthesis试剂盒（Tiangen Biotech Co.，Ltd.）将总共1µg的RNA转录成cDNA。反应条件如下：85℃5 min，4℃ 5 min。采用SYBR®Premix Ex Taq™ II试剂盒（TaKaRa）在ABI 7500 Fast系统（Applied Biosystems）上进行qPCR分析。热循环设置如下：在92℃下预变性5 min；在92℃变性15 s，在58℃退火30 s，在72˚C下延伸35 s，进行30个循环。β-actin用作加载对照。通过2-ΔΔCt计算每个基因的相对表达，并用β-actin进行归一化。用于qPCR扩增的引物序列如下：p53的正向引物序列为5'-AAGTAGAGAGGCATCGCAGAGA-3'，反向引物序列为5'-TTCGTTGCTGATTTACTCAGTAGG-3'；Bax的正向引物序列为5'-TCCTTCACCAATGTCAACTCC-3'，反向引物序列为5'-TGATTTTTCAGCCCATCCAC-3'；PARP-1的正向引物序列为5'-CTGTCGCTTCTCAATCAGACTC-3'，反向引物序列为5'-CCCAGGTCATTTCCCATCACTT-3'；caspase-3的正向引物序列为5'-CTGCTCTCCCTAACCCCTTGTC-3'，反向引物序列为5'-CACATAGGTAACGAGTCAGAGC-3'；β-actin的正向引物序列为5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3'，反向引物序列为5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3'。

2.5 细胞凋亡和细胞周期分析 使用膜联蛋白VFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（Sigma-Aldrich）检查细胞凋亡。将细胞接种在6孔板（每孔3×104细胞）中，置于培养箱培养24 h。然后加入5µL膜联蛋白VFITC和5 µL PI（50 mg/L）对细胞染色，在室温下避光孵育20 min。进行BD FACSAria I/II流式细胞术以测量细胞凋亡，并使用BD CellQuest Pro 3.3软件（均来自BD Biosciences）进行分析。使用PI染料试剂盒（Sigma-Aldrich）进行细胞周期测定。PC-3细胞在通过胰蛋白酶消化收获并用冷PBS洗涤后，将贴壁细胞在4%的70%乙醇中固定24 h。随后，将固定的细胞洗涤2次并用含有200µL PBS、1µL PI（1 g/L）和1µL RNase（10 g/L）的循环测试系统在37℃的黑暗中染色20 min。使用流式细胞术分析细胞周期。

3 统计学处理

使用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5软件进行统计分析。数据表示为均数±标准差（mean±SD）。多组间均数比较采用单因素方差分析，然后进行Student-Newman-Keuls多重比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ASF1B在PC-3细胞中的表达

通过Western blot检测ASF1B在BPH和PC-3细胞中的表达。结果表明，正常细胞（BPH）中ASF1B的蛋白水平显著低于PC-3细胞（P＜0.01），见图1。

Figure 1.Western blot was used to detect the ASF1B protein expression in BPH and PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs BPH group.图1 Western blot分析BPH和PC-3细胞中ASF1B的蛋白水平

2 siRNA-ASF1B降低PC-3细胞的活力

通过Western blot检测siRNA-ASF1B质粒在PC-3细胞中的转染效率。结果显示，与对照组和mock组相比，用siRNA-ASF1B质粒转染PC-3细胞后的ASF1B蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），图2A。使用MTT法测定PC-3细胞的活力，结果显示，与对照组和mock组相比，转染siRNA-ASF1B质粒的PC-3细胞的活力显著降低（P＜0.01），见图2B。转染12 h后，siRNA-ASF1B显著降低细胞活力，因此将siRNAASF1B转染持续时间设定为12 h。

3 流式细胞术分析结果

与对照组和mock组相比，转染siRNA-ASF1B质粒的PC-3细胞的凋亡率显著升高（P＜0.01），且细胞周期被阻滞于G1期，而G2和S期细胞数量显著减少（P＜0.01），见图3。

4 siRNA-ASF1B调节PC-3细胞中的凋亡相关因子

RT-qPCR结果表明，与对照组和mock组相比，用siRNA-ASF1B质粒转染PC-3细胞后，p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平上调（P＜0.01），见图4。

5 siRNA-ASF1B对PC-3细胞中MAPK/JNK/ERK信号通路影响

采用Western blot检测MAPK/JNK/ERK信号通路的蛋白表达水平。结果显示，与对照组和mock组相比，siRNA-ASF1B组PC-3细胞中MAP2K4和p-JNK蛋白水平显著升高（P＜0.01），而p-ERK蛋白水平显著降低（P＜0.01），见图5。

Figure 2.Western blot was used to detect the ASF1B protein expression in PC-3 cells after treatment for 12 h（A），and the viability of PC-3 cells was determined by MTT assay at 12，24，and 48 h after treatment（B）.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.图2 采用Western blot检测各组处理12 h后PC-3细胞中ASF1B蛋白表达，并采用MTT法测定各组细胞的活力

Figure 3.Flow cytometry was used to analyze the apoptosis（A）and cell cycle distribution（B）of PC-3 cells after treatment for 12 h.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.图3 流式细胞术分析各组处理12 h后PC-3细胞的凋亡和细胞周期分布

讨 论

目前已证实ASF1B对包括乳腺癌细胞和骨肉瘤细胞在内的多种细胞系的增殖为关键［7］。ASF1B可能直接上调与DNA复制相关的基因，能够补偿复制缺陷；ASF1B耗尽的细胞显示出形态改变的细胞核数量以及微核和核间DNA桥的数量显著增加［6］。这些研究表明ASF1B在有丝分裂过程中可能起作用。本研究显示，正常细胞（BPH）中ASF1B的蛋白水平显著低于PC-3细胞，这一结果与乳腺癌和宫颈癌中ASF1B的高表达相似［7］，提示ASF1B上调可能有助于PCa的生长、转移和分化。

Figure 4.RT-qPCR was used to analyze the mRNA expression of p53，caspase-3，Bax and PARP-1 in PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.图4 RT-qPCR分析PC-3细胞中p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平

Figure 5.Western blot was used to detect the effect of siRNA-ASF1B on MAPK/JNK/ERK signaling pathway in PC-3 cells.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs mock group.图5 Western blot检测siRNA-ASF1B对PC-3细胞中MAPK/JNK/ERK信号通路的影响

抗肿瘤药物和基因在促进肿细胞凋亡过程中发挥作用［8］。先前的一项研究表明，ASF1B的过度表达显著增强了乳腺癌的增殖［9］。本研究中，与对照细胞相比，siRNA-ASF1B显著下调了PC-3细胞的ASF1B表达，与此同时细胞凋亡率显著增加。细胞凋亡与细胞周期分布有关。凋亡的变化参与细胞周期阶段的调节，包括G1、G2和S期［10-12］。类似地，本研究数据显示，siRNA-ASF1B诱导PC-3细胞G1期阻滞，表明ASF1B沉默可促进PCa的细胞周期阻滞。为了进一步验证siRNA-ASF1B对细胞凋亡的抑制作用，我们检测了细胞凋亡相关因子的表达情况。结果显示，用siRNA-ASF1B质粒转染PC-3细胞后p53、caspase-3、Bax和PARP-1的mRNA水平上调［13-14］。这些结果表明，ASF1B的敲减通过提高p53、caspase-3、PARP和Bax的表达水平，加速了PC-3细胞的凋亡。

MAPK/JNK/ERK信号通路在细胞生长和增殖中起作用，并且已经观察到该通路在各种癌症类型中失调［15］。此外，抑制MAPK/JNK信号通路导致细胞活力降低，并可能增强 PCa的凋亡［16］，表明 MAPK/JNK信号通路在肿瘤进展过程中的作用。本研究中，siRNA-ASF1B组中PC-3细胞的MAP2K4和p-JNK蛋白水平显著升高（P＜0.01），表明ASF1B的敲减激活了MAPK/JNK途径，进而诱导细胞凋亡。另一方面，已知ERK1/2的激活能有效促进细胞存活［1］。本研究显示，p-ERK蛋白水平显著降低。这些结果强烈提示，ASF1B的沉默抑制了PCa的存活。因此，激活MAPK/JNK/ERK信号通路可能是siRNA-ASF1B在PCa中抗肿瘤作用的潜在机制之一。

总之，本研究结果表明ASF1B在PC-3细胞中高度上调；ASF1B沉默显著诱导PC-3细胞G1期阻滞，促进细胞凋亡；激活MAPK/JNK/ERK信号通路可能是siRNA-ASF1B抗肿瘤作用的机制之一。