RXRα激动剂贝萨罗汀通过调控TGF-β1/Smad2通路抑制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的形成*

许昌声， 张美金， 练桂丽， 彭 峰， 王华军， 林金秀， 柴大军

（福建医科大学附属第一医院心血管内科，福建高血压研究所，福建福州350005）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）已成为危及人类健康的全球性疾病之一，血管中膜平滑肌细胞增殖在其形成和发展过程中扮演重要角色［1-3］。前期研究结果证实，血脂代谢异常、血管内膜脂质沉积和血管中膜平滑肌细胞增生是载脂蛋白E缺陷（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠AS斑块形成与发展的病理基础，且转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad2信号通路参与 AS斑块内血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增生过程［4-6］，抑制TGF-β1/Smad2通路可减轻血管中膜肥厚，减少平滑肌层细胞增生，抑制动脉硬化斑块发展［7］。

类 视 黄 醇 X 受 体 α（retinoid X receptor α，RXRα）是核受体超家族的成员，可与其他核受体形成异二聚体，参与抗炎、抗氧化等多种细胞生物学效应［8］。我们前期观察发现RXRα在逆转病理性心肌肥厚、抑制内皮细胞氧化损伤及糖尿病心肌纤维化等方面具有重要的作用［9-10］，也证实了RXRα激动剂可通过改善糖脂代谢抑制动脉硬化的形成，但其分子机制尚不清楚。

本项工作应用小鼠模型，观察RXRα受体激动剂贝萨罗汀（bexarotene，Bex）对ApoE-/-小鼠AS斑块形成和VSMCs增生的作用，探讨RXRα受体对TGF-β1/Smad2通路的调控作用。

材料和方法

1 实验动物和主要试剂

SPF级ApoE-/-小鼠和C57BL/6小鼠，体重18～20 g，许可证号为SCXK（京）2011-0012，购于北京大学医学部。Bex（Eisai）；A83-01（Smad2磷酸化抑制剂）和TGF-β1（Sigma）；5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-bromodeoxyuridine，BrdU）细胞增殖试剂盒（Roche）；核蛋白提取试剂盒（上海碧云天公司）；Smad2和p-Smad2抗体（CST）；辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗（北京中杉公司）；丙烯酰胺和Tris-base（Ameresco）；PVDF膜（Millipore）；β-actin单克隆抗体和免疫印迹化学发光试剂（Santa Cruz）。

2 方法

2.1 实验动物和分组 根据文献［11］我们选用10只8周龄雄性C57BL/6小鼠为正常对照，30只8周龄雄性ApoE-/-小鼠为AS动物模型并随机分为3组：ApoE-/-组 、ApoE-/-+Bex5 （5 mg·kg-1·d-1Bex）组 、ApoE-/-+Bex10（10 mg·kg-1·d-1Bex）组。给药剂量参照祝江等［7］在糖尿病ApoE-/-小鼠AS研究的基础上进行改良。饲养条件：室温（22±2）℃，湿度（55±5）%，人工光照明暗各12 h/d，自由取食饮水，饲料由上海斯莱克公司提供。将Bex溶于生理盐水中，灌胃法给药，每天1次，连续8周，C57BL/6和ApoE-/-组小鼠均予等体积生理盐水灌胃。

2.2 HE染色 取小鼠胸主动脉弓下0.5 cm血管段，PBS洗涤1～2次，4%甲醛固定，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、HE染色，中性树脂封片，显微镜下拍照，采用自动成像分析软件系统（Image 5.0）计算胸主动脉内膜斑块面积。

2.3 组织块贴壁法培养VSMCs 取ApoE-/-小鼠（8周龄）胸主动脉，置于盛有M199液的培养皿中，去除血管外膜后剪碎（1 mm×1 mm×1 mm），M199液冲洗2～3次，将组织块转移至培养瓶，平铺，吸弃培养液，于组织块对侧加入4～5 mL含10%FBS的M199培养液，倾斜45°于培养箱静置2～3 h，翻转培养瓶平放，3～4 d更换2/3培养液，待细胞铺满70%～80%瓶底，采用0.25%胰酶消化传代，传3～6代细胞进行干预实验。

2.4 蛋白提取和Western blot实验 取ApoE-/-小鼠胸主动脉（隔肌上）长约1 cm，剥去血管外膜组织，PBS漂洗1～2次，加0.5 mL RIPA裂解缓冲液匀浆，加入等体积2×SDS上样缓冲液，震荡15 s，100℃水浴煮10 min，12 000×g、4℃离心10 min，取上清-80℃保存备用。依据产品说明书，采用核蛋白提取试剂盒提取VSMCs总蛋白、胞浆及胞核蛋白。蛋白经凝胶电泳、转膜、封闭后加Smad2和p-Smad2抗体（1∶1 000），Ⅱ抗（1∶5 000）孵育、显影，以β-actin（1∶2 000）为内参照，以目的蛋白/β-actin比值作为蛋白表达水平。

2.5 BrdU掺入法检测VSMCs增殖水平 选取3～6代VSMCs接种于96孔培养板（每孔2×103个细胞），待细胞生长至60%～70%汇合时弃培养基，用无血清M199培养液洗涤2次，加入0.9 mL含0.5%FBS的M199培养液培养24 h，在干预的同时加每孔10µL 10×BrdU原液孵育24 h。弃上清，PBS漂洗1次，4%甲醛固定30 min，弃固定液，PBS漂洗3次，加HRP标记的BrdU抗体（1∶100）于37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每孔加反应液100 µL，37℃孵育10～20 min，加终止液，酶标仪检测吸光度（A）值（波长450 nm），以A值表示细胞增殖水平。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行实验数据分析处理，结果以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较使用最小显著性差异（least significant difference，LSD）法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Bex对ApoE-/-小鼠生化指标的影响

与C57BL/6组相比，ApoE-/-组小鼠空腹血清甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平均显著增加（P＜0.01），但ApoE-/-组、ApoE-/-+Bex5组和ApoE-/-+Bex10组之间TG、TC和LDL-C水平均无显著差异（P＜0.05）；各组间高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、天门冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及血清肌酐（serum creatin，SCr）水平均无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1 Bex对ApoE-/-小鼠生化指标的影响Table 1.Effects of Bex on blood biochemical parameters of ApoE-/-mice（Mean±SD.n=10）

2 Bex抑制ApoE-/-小鼠胸主动脉内膜粥样斑块的形成

C57BL/6组小鼠的血管内膜光滑，未见脂质斑块形成；ApoE-/-小鼠血管内膜可见巨大硬化斑块突起，中膜厚薄不均，斑块内及底部可见大量组织增生；ApoE-/-+Bex5组和ApoE-/-+Bex10组小鼠血管壁中膜较为规则，内膜斑块较小，斑块周围及底部只见少量组织增生。斑块面积分析：与C57BL/6组相比，ApoE-/-组血管内膜斑块面积显著增大（P＜0.01）；与ApoE-/-组相比，ApoE-/-+Bex5组及ApoE-/-+Bex10组斑块面积显著减小（P＜0.01）；ApoE-/-+Bex10组与ApoE-/-+Bex5组相比斑块面积显著减小（P＜0.05）。见图1。

3 Bex对 ApoE-/-小鼠胸主动脉 TGF-β1、p-Smad2及Smad2蛋白水平的影响

与C57BL/6组相比，ApoE-/-组小鼠胸主动脉的TGF-β1和p-Smad2水平均显著增加（P＜0.01）；Bex可增加胸主动脉p-Smad2水平，表现为ApoE-/-+Bex5和ApoE-/-+Bex10组小鼠胸主动脉的p-Smad2水平较ApoE-/-组显著增加（P＜0.01），且ApoE-/-+Bex10组p-Smad2水平显著高于ApoE-/-+Bex5组（P＜0.01）；但ApoE-/-组、ApoE-/-+Bex5组和ApoE-/-+Bex10组之间TGF-β1和Smad2的表达均无显著差异（P＞0.05），见图2。

Figure 1.Bex treatment decreased plaque size in the thoracic aorta of ApoE-/-mice（HE staining，scale bar=200µm）.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs C57BL/6 group；##P＜0.01 vs ApoE-/-group；&P＜0.05 vs ApoE-/-+Bex5 group.图1 Bex抑制ApoE-/-小鼠胸主动脉内膜粥样斑块的形成

4 Bex和Smad2磷酸化抑制剂A83-01均可抑制TGF-β1诱导的VSMCs增殖

BrdU掺入率检测结果显示，TGF-β1（0.1～10µg/L）呈浓度依赖性促进VSMCs增殖，当TGF-β1干预浓度达到5µg/L时，BrdU掺入率达到高峰，见图3A。Bex则呈浓度依赖性抑制TGF-β1（5µg/L）诱导的VSMCs增殖，与TGF-β1组相比，Bex（10-7mol/L）+TGF-β1组VSMCs的BrdU掺入率显著降低（P＜0.01）；当用Smad2磷酸化抑制剂A83-01（20 nmol/L）预处理VSMCs后，TGF-β1诱导的VSMCs增殖效应亦被显著抑制（P＜0.01），见图3B。

5 Bex促进VSMCs中TGF-β1诱导的Smad2磷酸化

Figure 2.Effects of Bex on the protein levels of TGF-β1，p-Smad2 and Smad2 in thoracic aorta tissues of ApoE-/-mice.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs C57BL/6 group；##P＜0.01 vs ApoE-/-group.图2 Bex对 ApoE-/-小鼠胸主动脉 TGF-β1、p-Smad2及Smad2表达的影响

当用 TGF-β1（5 µg/L）干预 VSMCs 60～90 min时，细胞内p-Smad2蛋白水平显著增加（P＜0.01），但未对Smad2总蛋白水平产生影响，见图4A。当用Bex（10-7mol/L）预处理VSMCs后，再予TGF-β1诱导VSMCs 60 min，p-Smad2蛋白水平则显著增加（P＜0.01），但各组间Smad2总蛋白水平无显著差异（P＞0.05），见图4B。

6 Bex抑制VSMCs中TGF-β1诱导的p-Smad2核转位

提取各组细胞总蛋白并分离和纯化胞质和胞核蛋白，Western blot结果显示，与对照组相比，TGF-β1（5µg/L）组VSMCs胞质及胞核的p-Smad2水平均显著升高（P＜0.01）；但与 TGF-β1（5 µg/L）组相比，TGF-β1（5 µg/L）+Bex（10-7mmol/L）组 VSMCs胞质的p-Smad2水平显著升高（P＜0.01），胞核的p-Smad2水平却显著降低（P＜0.01）；各组细胞的胞质或胞核Smad2水平均无显著差异（P＞0.05），见图5。

讨 论

Figure 3.Bex and Smad2 phosphorylation inhibitor A83-01 inhibited TGF-β1-induced proliferation of VSMCs.A：the VSMCs were incubated with TGF-β1（0～10 µg/L）and BrdU（1 mg/L）for 24 h，and the proliferation activity was determined；B：the VSMCs were pretreated with the indicated concentration of Bex for 30 minutes and then exposed to TGF-β1（5 µg/L）and Brdu（1 mg/L）for 24 h.Mean±SD.n=8.**P＜0.01 vs control（0 µg/L TGF-β1）group；▲P＜0.05 vs TGF-β1（5 µg/L）group.图3 Bex及Smad2磷酸化抑制剂A83-01抑制TGF-β1诱导的VSMCs增殖

ApoE-/-小鼠已被广泛应用于高脂血症和AS及其并发症的研究。本研究结果显示，与C57BL/6组相比，ApoE-/-小鼠的血清TG、TC和LDL-C水平均显著增高，胸主动脉内膜有巨大的粥样斑块形成及中膜平滑肌层大量增生。ApoE-/-小鼠AS的发生除与血脂异常有关外，血管中膜平滑肌层细胞增生在其形成和发展过程中也起重要作用［1-3］。血脂异常升高，血管内膜脂质沉积，血管中膜平滑肌层细胞增生是AS发生和发展共同的病理基础［13］。在本研究中，当ApoE-/-小鼠给予RXRα激动剂Bex治疗时，Bex可呈剂量依赖性的抑制ApoE-/-胸主动脉内膜脂质斑块的形成，减少动脉硬化斑块面积，抑制斑块周围及底部中膜平滑肌层增生。由于Bex治疗未对ApoE-/-小鼠血脂产生显著影响，我们推测RXRa激动剂Bex改善ApoE-/-小鼠AS机制可能与降脂效应无关。

我们前期观察到阿托伐他汀可通过RXRα抑制内皮细胞氧化应激，减少ApoE-/-小鼠胸主动脉AS斑块面积，这一结果表明RXRα参与该过程并发挥介导作用，且可能是机体AS形成的内源性保护因素［10］。已有研究显示，动脉内膜损伤可触发组织炎症和氧化应激反应，通过激活TGF-β1/Smad2信号通路促进VSMCs增殖与基质合成，抑制TGF-β1/Smad2活性可削弱上述效应，改善血管重构，减少动脉硬化的发生，因此，TGF-β1/Smad2是VSMCs增殖和基质合成的重要调控通路［2，14-15］。我们也观察到 ApoE-/-小鼠胸主动脉的TGF-β1和p-Smad2蛋白水平均显著增加，同时也观察到胸主动脉平滑肌层不规则增厚，斑块周围及底部有大量细胞增生，再次证明了VSMCs增殖是ApoE-/-小鼠动脉粥样斑块形成的重要机制之一，且VSMCs增生与TGF-β1/Smad2信号通路活化有关。既往研究已证实TGF-β1增加p-Smad2水平促进VSMCs细胞增生。在实验中，Bex治疗未改变ApoE-/-小鼠胸主动脉的TGF-β1含量，但p-Smad2磷酸化水平显著增高，同时动脉中膜变薄，斑块内增生组织减少，斑块面积缩小，我们在体外细胞实验也观察到Bex可增加VSMCs中TGF-β1诱导的p-Smad2水平，却使其增殖水平降低，这结果与既往认为的p-Smad2水平增加促进细胞增殖不一致，我们推测Bex发挥上述细胞学效应还可能存在其他重要机制。有研究者在TGF-β1/Smad2信号通路与细胞增殖研究中发现细胞增殖不仅与Smad2磷酸化水平有关，还与p-Smad2细胞核转位有关［15-16］。我们推测核受体RXRα可能通过抑制p-Smad核转位从而抑制TGF-β1信号传导。也有研究RXRα受体激动后能增加TGF-β1上调p-Smad2的水平，但抑制p-Smad2向细胞核转位，抑制TGF-β1/Smad2通路的促细胞增殖活性［17-18］。我们在RXRα调控大鼠心肌成纤维细胞胶原合成的相关研究中也检测到RXRα活化显著增加TGF-β1诱导的成纤维细胞胞浆p-Smad2水平，但抑制p-Smad2核转位进而抑制成纤维细胞胶原合成［19］。因此，我们推测Bex增加ApoE-/-小鼠胸动脉p-Smad2水平却抑制动脉中膜VSMCs增生可能与RXRα抑制p-Smad2核转位有关。

Figure 4.Effects of Bex on TGF-β1-induced Smad2 phosphorylation in VSMCs.A：TGF-β1（5 µg/L）induced Smad2 phosphorylation in the VSMCs；B：the VSMCs were treated with Bex（10-7mmol/L）for 30 min and then exposed to TGF-β1（5 µg/L）for 60 min.Mean±SD.n=4.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs TGF-β1（5 µg/L）group.图4 Bex对TGF-β1诱导的VSMCs中Smad2磷酸化的影响

Figure 5.Bex inhibited nuclear translocation of p-Smad2 induced by TGF-β1 in VSMCs.The VSMCs were treated with Bex（10-7mmol/L）or TGF-β1（5 µg/L）for 60 min，or pretreated with Bex（10-7mmol/L）followed by exposure to TGF-β1（5 µg/L）for 60 min.Nuclear，cytosolic（Cyto）and total extracts were prepared and analyzed by Western blot.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vscontrolgroup；▲▲P＜0.01vsTGF-β1（5µg/L）group.图5 Bex抑制VSMCs中TGF-β1诱导的p-Smad2核转位

体外细胞实验结果显示，RXRa激动剂Bex可抑制 TGF-β1诱导 VSMCs增殖，并协同 TGF-β1增加VSMCs胞浆p-Smad2水平，而VSMCs胞核内p-Smad2水平显著降低；另外p-Smad2抑制剂A83-01也能显著降低TGF-β1诱导的VSMCs细胞增殖水平，这一结果也证实了TGF-β1诱导VSMCs细胞增殖水平与VSMCs的p-Smad2总水平有关，也说明p-Smad2只有在细胞核内才能发挥调节细胞增殖的作用。既往研究已显示，细胞在静息状态下，Smad2蛋白主要位于细胞胞浆中，但当Smad2被外来信号刺激后，Smad2蛋白迅速磷酸化并向胞核内聚集从而介导细胞转录活性［18-20］。Cao等［18］在体外培养的NIH-3T2细胞中发现RXRa受体激动后可与Smad2结合形成二聚体，可协同TGF-β1诱导增加p-Smad2水平，但p-Smad2未能与RXRa分离，限制p-Smad2从胞质向胞核内聚集，导致p-Smad2介导的转录作用失活，这进一步说明Smad2活性不但与其磷酸化水平有关，而且与p-Smad2是否在胞核内集聚有关。因而Bex虽增加TGF-β1诱导的VSMCs胞浆p-Smad2水平，但可抑制p-Smad2核转位，从而消除TGF-β1诱导VSMCs增殖的作用。

综上所述，本研究结果显示RXRα受体激动剂Bex具有抗AS作用，且通过调控TGF-β1/Smad2通路p-Smad2核转位抑制胸主动脉VSMCs增生可能是其重要机制。