血府逐瘀汤对肺纤维化大鼠肺组织上皮间质转化的影响及其机制研究

武运邦 谢 红 王金义 肖开苹 潘欣阳 杨邯捷 赵惠亮 渠景连

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025

肺纤维化(Pulmonary Fibrosis，PF)是一种多病因且发病机制不明确的肺部疾病，其主要病理变化是初期的弥漫性肺泡炎和后期的成纤维细胞增殖、转化以及细胞外基质的过度沉积[1]。其中，肺泡上皮细胞的易损性、异常重塑、表型改变是肺纤维化发生的关键[2]。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal Transition，EMT)是上皮细胞向间质表型转化的过程，在这一过程中，上皮细胞标志物如E-钙黏蛋白(E-cadherin)逐渐丢失，而间质细胞标志物如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达升高[3]。研究表明，EMT与肺纤维化密切相关，它被证明是肌成纤维细胞的主要来源，而肌成纤维细胞通过分泌细胞外基质参与组织纤维化[4]。在EMT过程中，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号通路被激活，Smad3作为TGF-β信号通路中一个重要的组成部分，对于TGF-β1介导的EMT极其重要[5]。

中医学理论认为肺纤维化的病变实质是“肺络瘀滞”，故活血化瘀通络是该病的主要治法。血府逐瘀汤出自于清代医家王清任《医林改错》，是活血化瘀的代表方剂。临床研究表明，血府逐瘀汤对肺纤维化的抑制与改善作用明显[6-7]，关于该方药理作用的研究也逐渐增多，但尚未见从EMT角度进行研究的报道。本研究以EMT为切入点，探讨血府逐瘀汤对PF模型大鼠肺组织EMT的影响，并从TGF-β1/Smad3出发进一步分析其可能机制，以期为阐明该方防治PF的作用机制提供参考。

1 材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠48只，雄性，体质量(200±20)g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，合格证号：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 药物与试剂 血府逐瘀汤由桃仁、川芎、桔梗、赤芍、枳壳、甘草、柴胡、红花、当归、生地黄、牛膝组成，药物购自贵阳同仁堂药房。其中：桃仁(批号：170401，产地：山东)；川芎(批号：170701，产地：安徽)；桔梗(批号：170301，产地：安徽)；赤芍(批号：170401，产地：内蒙古)；枳壳(批号：170401，产地：江西)；甘草(批号：180301，产地：新疆)；柴胡(批号：170301，产地：山西)；红花(批号:171201，产地：新疆)；当归(批号：170701，产地：甘肃)；生地黄(批号：171201，产地：河南)；牛膝(批号：170401，产地：河南)。分别煎制浓缩为含生药0.351、0.702、1.404 g·mL-1的合剂，每次制备3 d药量，4 ℃冰箱保存备用。

醋酸地塞米松片(批号：151238，浙江仙琚制药股份有限公司)；博来霉素(批号：16032311，海正辉瑞制药有限公司)；α-SMA抗体(一抗，兔源，批号：AG02247616，北京博奥森生物技术公司)；Smad3抗体(一抗，兔源，批号：GR3190902-12，英国abcam公司)；TGF-β1抗体(一抗，兔源，批号：55e6713，Affinity公司)；E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体(一抗，兔源，批号：18k0657，Affinity公司)；β-actin抗体(一抗，小鼠源，批号：48k2671)、山羊抗兔辣根过氧化酶标记二抗(批号：3825j63)、山羊抗小鼠辣根过氧化酶标记二抗(批号：1292k61)均购自美国Affinity Biosciences公司；Mayer苏木素染液(批号：20170526)、DAB显色试剂盒(批号：20170511)均购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号：SE248353，美国Thermo Scientific公司)；ECL发光液(批号：1716501)、PVDF膜(批号：MB0323)均购自默克密理博有限公司。

1.3 主要仪器 Allegra X-30R离心机(美国BECKMAN公司)；GNP-9080隔水式电热恒温培养箱(苏州威尔实验用品有限公司)；1150H石蜡包埋机(德国Leica公司)；RM2265轮转切片机(德国Leica公司)；PL303电子天平(梅特勒-托利多仪器公司)；BX 53显微图像采集系统(日本OLYMPUS公司)；PowerPacTMBasic电泳仪(美国Bio-Rad公司)；ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software凝胶成像系统(美国Bio-Rad 公司)等。

2 方法

2.1 动物分组及模型制备 将大鼠常规适应性饲养7d后，随机分为6组：正常组、模型组、地塞米松组、血府逐瘀汤高、中、低剂量组，每组8只。除正常组外，其余各组均采用气管滴注博来霉素复制PF模型[8]：用10%水合氯醛 3 mL·kg-1麻醉大鼠后，颈部皮肤消毒，剪去颈部鼠毛，行颈正中切口，分离暴露气管。经气管软骨环间隙向心端穿刺注入博来霉素5 mg/kg，在注射过程中必须非常缓慢的注入，并且边注射边观察大鼠胸廓的起伏，防止堵塞气道，导致大鼠的死亡。注射完成后立即将动物直立并旋转，使药液在肺内分布充分、均匀，然后缝合皮肤。正常组动物在同样条件下注入等量生理盐水。术后让大鼠自由饮水、进食。

2.2 给药 造模后第2 d开始每天灌胃给药，正常组和模型组予蒸馏水溶液(10 mL·kg-1·d-1)；地塞米松组予等容积地塞米松蒸馏水溶液(0.000405 g·kg-1·d-1)；血府逐瘀汤高剂量组(14.04 g·kg-1·d-1)、血府逐瘀汤中剂量组(7.02 g·kg-1·d-1)和血府逐瘀汤低剂量组(3.51 g·kg-1·d-1)分别给予等容积药液。每日灌胃1次，连续给药28 d。

2.3 标本采集 治疗后第28 d，以10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉大鼠，股动脉放血后剖取两肺，剪除气管、支气管，将左肺组织用冰盐水冲洗3遍，滤纸吸干水分，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，常规脱蜡，用免疫组化法检测肺组织上皮细胞标志物(E-cadherin)和间质细胞标志物(α-SMA)的表达水平。右肺分装于1.5 mL EP管，转存-80 ℃冰箱冻存，用蛋白免疫印迹法(Western blot)观察各组肺组织中TGF-β1 和Smad3的蛋白表达变化。

2.4 免疫组化法检测肺组织中E-cadherin和α-SMA的表达 将石蜡切片放于60 ℃烤箱中2 h；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各2 min脱蜡至水；3%H2O2室温灭活10～15 min；PBS冲洗3次/5分钟；抗原热修复10 min，冷却至室温；PBS冲洗3次/5分钟；滴加封闭液5% BSA，滴加一抗，4℃孵育过夜；PBS冲洗3次/5 min；滴加二抗，湿盒内37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次/5 min；DAB显色，苏木素核复染，梯度乙醇逐步脱水，二甲苯进行透明，最后用中性树胶封片。光学显微镜下随机观察5个视野、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定每个视野阳性细胞的平均光密度值，以此反映相应蛋白的表达水平。

2.5 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肺组织中TGF-β1和Smad3的表达 取大鼠右肺上叶肺组织100 mg，加入1 mL预冷的裂解液，用电动匀浆器在冰上匀浆，于4 ℃下以12000 r·min-1离心20 min，收集上清液；取少量上清液进行蛋白定量；剩下的加入等体积2×上样缓冲液，95℃水浴煮5 min后于-80 ℃冰箱保存，备测。取上述蛋白适量进行SDS-PAGE电泳(电压100 V，时间1.5 h)，电泳结束后转移至PVDF膜后，于5%脱脂奶粉中封闭1 h；分别加入一抗溶液(TGF-β1、Smad3兔单克隆抗体，稀释度为1∶5000)孵育，4℃ 孵育过夜；取出PVDF膜，TBST洗3次；加入二抗常温孵育1 h，取出PVDF膜，TBST洗3次，经ECL显色后于凝胶成像系统中显影；采用ImageJ 1.51K软件进行分析，以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比值表示相应蛋白的表达水平。

3 结果

3.1 血府逐瘀汤对肺纤维化大鼠肺组织E-cadherin、α-SMA表达的影响 模型组大鼠肺组织E-cadherin表达显著低于正常组(P<0.01)，而α-SMA表达显著高于正常组(P<0.01)。与模型组比较，血府逐瘀汤高、中、低剂量组肺组织E-cadherin表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)，而α-SMA表达显著降低(P<0.05或P<0.01)；与地塞米松组比较，血府逐瘀汤低剂量组的E-cadherin表达显著降低(P<0.05)，而α-SMA表达显著升高(P<0.05)。见表1、图1和图2。

表1 血府逐瘀汤对肺纤维化大鼠肺组织E-cadherin、α-SMA表达的影响

A.正常组；B.模型组；C.血府逐瘀汤高剂量组；D.血府逐瘀汤中剂量组；E.血府逐瘀汤低剂量组；F.地塞米松组

A.正常组；B.模型组；C.血府逐瘀汤高剂量组；D.血府逐瘀汤中剂量组；E.血府逐瘀汤低剂量组；F.地塞米松组

3.2 血府逐瘀汤对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1、Smad3表达的影响 模型组大鼠肺组织TGF-β1、Smad3的表达显著高于正常组(P<0.01)。与模型组比较，血府逐瘀汤高、中、低剂量组肺组织TGF-β1、Smad3表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)；与地塞米松组比较，血府逐瘀汤低剂量组的TGF-β1、Smad3表达显著升高(P<0.01)。见表2、图3。

表2 血府逐瘀汤对肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1、Smad3表达的影响

A.正常组；B.模型组；C.血府逐瘀汤高剂量组；D.血府逐瘀汤中剂量组；E.血府逐瘀汤低剂量组；F.地塞米松组

4 讨论

PF是肺组织受损后人体自身修复的结果，也是以成纤维细胞增殖以及细胞外基质过度沉积并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的多种肺部疾病的最终结局。临床主要表现为干咳、进行性呼吸困难，且随着病情加重，呼吸功能不断恶化，严重影响患者的生活质量。如前所述，EMT是上皮细胞在形态学上发生间充质细胞表型的转变，其在PF和肌成纤维细胞活化的发展中起关键作用。EMT发生时，上皮细胞极性消失，上皮细胞标志物下调，细胞骨架重排，迁移和运动能力增强，同时获得间质细胞特性，间质细胞标志物上调[3]。

研究表明，多种细胞因子参与了EMT过程，尤其是TGF-β1，是目前公认的促进EMT的核心细胞因子[9]，在此过程中，TGF-β1促进了上皮细胞表型的丢失。TGF-β1介导EMT的途径众多，但主要依赖Smad途径[10]。Smad蛋白家族是一类细胞内TGF-β受体激酶的底物[11]，其本身既是转录因子，也是其他转录因子如Slug、Snail、Scatter、淋巴增强因子1、β连环蛋白等的诱导物[12]。Smad3控制一系列Smad依赖的靶基因转录[13]，TGF-β1受体丝氨酸-苏氨酸激酶激活Smad2/3后，使其磷酸化，Smad3与Smad4结合形成复合物进入到细胞核，从而与其他转录因子共同调控靶基因的转录，最终导致EMT及PF的发生。Wang等[14]在博来霉素诱导的肺纤维化模型小鼠中发现，热休克蛋白27和Smad3表达均增加，进而激活细胞外调节蛋白激酶信号通路促进EMT。

中医学认为PF的病变实质是“肺络瘀滞”。肺为娇脏，外易受六淫之邪，内可生瘀血为患，诸因素均可闭阻气机，导致肺络之气血运行受阻，气血不畅，更易酿生瘀血，从而造成肺络瘀滞而发病[15]。李菊莲等[16]也认为本病早期毛细血管增生、扩张、充血，管壁增厚，晚期由于大量纤维结缔组织增殖而收缩，毛细血管数量减少甚至闭锁，说明PF存在肺络瘀滞病机。“络以通为用”，因此，治疗本病当以活血通络为主。血府逐瘀汤是王清任所创的活血化瘀五大名方之一，由桃仁、红花、当归、生地黄、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡，枳壳、甘草组成。诸药合用，不仅可行血分之瘀滞，又可解气分之郁结，寓行气于活血之中，寓养于行散之中，活血而不耗血，袪瘀又能生新，升降同用，使瘀血下行，气机畅达，脏腑和调。现代药理研究表明，血府逐瘀汤可通过抑制Smad3、MMP-7的蛋白表达来降低肺纤维化程度[17]，此外对氧自由基损伤也有不同程度的干预作用，并可通过降低血清HA、肺组织HYP、胶原蛋白含量及提高弹性纤维含量来改善其细胞外基质代谢[18]。在此基础上，本研究以疗效较好的地塞米松为阳性对照，探讨了血府逐瘀汤对PF模型大鼠肺组织中上皮细胞标志物、间质细胞标志物表达以及TGF-β1/Smad3信号通路的影响。

本研究结果显示，模型组大鼠肺组织E-cadherin表达较正常组显著降低，而α-SMA表达较正常组显著升高，提示模型复制成功。给予不同剂量的血府逐瘀汤后，各给药组大鼠E-cadherin表达显著升高，而α-SMA表达显著降低，表明该方可不同程度地上调E-cadherin表达，下调α-SMA表达，提示该方防治PF的作用可能与抑制EMT有关。进一步研究结果显示，模型组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad3的表达显著升高，提示PF发生后TGF-β1/Smad3信号通路被激活，给予不同剂量的血府逐瘀汤后，大鼠肺组织TGF-β1、Smad3表达均显著降低，提示血府逐瘀汤治疗PF的机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。此外，本研究结果还显示，血府逐瘀汤低剂量组大鼠肺组织E-cadherin表达显著低于地塞米松组，α-SMA、TGF-β1、Smad3表达显著高于地塞米松组，而中、高剂量组与地塞米松组比较差异无统计学意义，提示中剂量组(7.02 g·kg-1·d-1)、高剂量组(14.04 g·kg-1·d-1)血府逐瘀汤对PF模型的改善作用与地塞米松相当。

综上所述，血府逐瘀汤可通过干预EMT来减轻模型大鼠的肺纤维化，其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关，但其具体机制还有待进一步研究。